Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie kultur MSC szczurów
- Pobieranie MSCs z kości udowej
- Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. cienkie nożyczki do preparowania, nożyczki do cięcia z końcówkami i kleszcze zębate) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
- Przygotować pożywkę MSC składającą się z minimalnej ilości niezbędnej pożywki - modyfikacji alfa (αMEM) uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną/streptomycyną (P/S, 1% v/v).
- Uśmiercenie młodych samców szczurów Sprague Dawley (200-250 g masy ciała) przez przedawkowanie pentobarbitonu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowe).
nuta: Próbki szpiku od różnych szczurów powinny być przetwarzane oddzielnie.
- Uśmiercone zwierzęta należy umieścić w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch i kończyny dolne 70% etanolem.
- Usuń skórę i tkankę podskórną nad przyśrodkowymi udami za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Usuń mięśnie ud obwodowo, aż kość udowa zostanie odsłonięta. Kontynuuj to proksymalnie i dystalnie, aż zobaczysz stawy kolanowe i biodrowe. Odłącz kość udową przez staw biodrowy i kolanowy za pomocą nożyczek tnących z końcówką.
nuta: Na tym etapie nie należy przechodzić przez kość udową w celu odsłonięcia jamy szpiku. Przenieś nienaruszone kości udowe do okapu do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym w celu dalszego przetwarzania.
- Użyj nożyczek tnących z końcówką, aby przeciąć dystalny i proksymalny koniec kości udowej przez przynasadę.
- Umieść sitko o pojemności 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Włożyć strzykawkę o pojemności 21 g i pojemności 10 ml zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) do odsłoniętego kanału udowego i przepłukać zawartość szpiku do stożkowej rurki przez wielokrotne płukanie.
nuta: Około 20 ml PBS zużywa się do przepłukania każdej kości udowej. Jeśli kolor zaczerwienionej zawartości pozostaje zabarwiony krwią i mętny, można użyć większej objętości.
- Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 480 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ). Zapisz początkowy dzień posiewu jako dzień 0,
nuta: Na wszystkich etapach związanych z wirowaniem należy ustawić hamulec na maksymalne opóźnienie.
- Zakładanie i rozbudowa kolonii MSC
nuta: Protokół ten opiera się na przyleganiu plastiku do hodowli tkankowej w celu wyselekcjonowania MSC z jamy szpiku. Zawartość szpiku kostnego może przylegać do plastiku hodowli tkankowej przez 2 dni.
- W drugim dniu przepłucz płytki hodowlane trzykrotnie 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po spłukaniu zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umyj komórki PBS i uzupełniaj je pożywką MSC co 3 dni.
nuta: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu (ryc. 1A).
- Przejdź komórki do 10 dnia, usuwając pożywkę wzrostową i przepłukując komórki PBS. Dodać 1,5 ml rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 3 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min.
- Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.
- Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10-centymetrową płytkę hodowlaną w pożywce wzrostowej MSC.
nuta: MSC szczurów powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od pasażu (ryc. 1B). Komórki mogą być pasażowane zgodnie z opisem w kroku 1.2.2 dla maksymalnie 8 przejść. MSCs można scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego (ryc. 2). Tylko posiewy MSC między pasażami 3 i 8 są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych progenitorów. MSCs o większej liczbie pasaży przyjmują spłaszczoną morfologię (ryc. 1C) i nie wytwarzają wystarczającej liczby progenitorów nerwowych. Te kultury należy wyrzucić.
2. Przygotowanie ludzkich kultur BMSC
- Rozcieńczyć 1 ml ludzkiego szpiku kostnego w 9 ml pożywki wzrostowej MSC i umieścić komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Utrzymywać kultury w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ).
- Usuń pożywkę po 2 dniach i delikatnie spłucz kultury trzykrotnie 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po ostatnim płukaniu usuń PBS i zastąp go 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Uzupełniaj pożywkę po każdych 3 dniach hodowli po płukaniu PBS.
nuta: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu. Liczba kolonii może się różnić w zależności od obiektu.
- Przejść przez komórki w 10 dniu, jak opisano w kroku 1.2.2. Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS. Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10 cm płytce hodowlanej w pożywce wzrostowej MSC.
nuta: Ludzkie MSCs (ryc. 1D) wykazują podobną morfologię do MSCs szczurów i powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od pasażu. Należy je scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego. Podobnie jak w przypadku MSCs szczurów, ludzkie MSCs między pasażami 3 i 8 są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych komórek progenitorowych.
3. Kondycjonowanie wstępne hipoksyjne
- Zdemontuj elementy komory hipoksji (tj. podstawę, pokrywę, tace) po zwolnieniu zacisku pierścieniowego i wyczyść poszczególne części 70% etanolem. Umieść elementy komory w okapie do hodowli tkanek z przepływem laminarnym w celu sterylizacji w świetle UV przez 15 minut.
- Przed wstępnym kondycjonowaniem hipoksyjnym należy usunąć pożywkę i przepłukać posiewy MSC szczurów i ludzi (sekcje 1 i 2) 10 ml PBS. Zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC uzupełnionej 25 mM HEPES.
nuta: MSCs hodowane na 10-centymetrowych szalkach powinny osiągnąć 80-90% konfluencji, zanim zostaną poddane wstępnemu kondycjonowaniu hipoksyjnemu.
- Umieść szalki hodowlane w komorze hipoksji. Ponownie zmontuj elementy komory i dokręć pierścień clamp. Mieszaninę gazów o stężeniu 99% N2/1% O2 należy przepłukać do komory o natężeniu przepływu 10 l/min przez 5 minut.
- Uszczelnij końce łączące komorę hipoksji, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu. Umieścić komorę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 16 godzin.
- Po zakończeniu kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego należy usunąć kultury z komory, przygotowując się do późniejszej hodowli wzbogacającej neuronalne pregenitory.
4. Kultura wzbogacania neuronalnych przodków
- Przygotuj neuronalną pożywkę progenitorową składającą się ze zmodyfikowanej pożywki orła firmy Dulbecco/mieszanki składników odżywczych szynki F12 (DMEM/F12) uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF, 20 ng/mL) i P/S (1% v/v).
- Odłączyć wstępnie kondycjonowane do hipoksyjności MSCs szczura/człowieka, jak opisano w kroku 1.2.2. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.
- Ponownie zawiesić komórki w pożywce progenitorowej neuronu i wysiać nasiona na 6-dołkowych płytkach o niskim przyleganiu o gęstości 6,000 komórek/cm2. Umieścić kulturę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 12 dni. Uzupełniaj 75% pożywki progenitorowej układu nerwowego co 3 dni.
nuta: Duże skupiska komórek nieprzylegających należy zaobserwować w 6-7 dniu. W dniach 10-12 można zaobserwować neurosfery o średnicy ≥ 100 μm (ryc. 3). Wstępnie kondycjonowane MSCs powinny dawać więcej neurosfer niż MSCs hodowane w warunkach normoksyjnych.
- Zbierz neurosfery w 12 dniu, odsysając je do pipety o pojemności 10 ml i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować neurosfery przy 250 x g przez 5 min.
nuta: Neurosfery można scharakteryzować w 12 dniu pod kątem markerów progenitorowych neuronów, takich jak gniazdyna i GFAP.
5. Generowanie komórek Schwanna
- Przygotować pożywkę do indukcji glejowej składającą się z αMEM uzupełnionego β-hereguliną (100 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), płytkowym czynnikiem wzrostu (PDGF-AA, 5 ng/ml), FBS (10%) i P/S (1% v/v).
- Umieść neurosfery przygotowane w sekcji 4 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL / lamininą o gęstości 5-10 kulek nacm2 w 1,5 ml pożywki do indukcji glejowej na dołek. Pożywkę do indukcji glejowej należy wymieniać co 2 dni po przepłukaniu komórek PBS.
nuta: Obserwuje się, że komórki z zasianych neurosfer migrują na zewnątrz do 2 dnia. Do 7 dnia komórki migrujące mają zwężający się wygląd i powinny wykazywać immunopozytywność dla markerów komórek Schwanna: receptora neurotrofiny p75 (p75) i S100β. Komórki te są określane jako SCLC.
