Generowanie komórek Schwanna zaangażowanych przez los poprzez kokulturę z neuronami DRG
1. Przygotowanie oczyszczonych neuronów DRG szczura
- Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. nożyczki do preparowania, kleszcze, dwa kleszcze do mikrodysekcji i nożyczki do mikropreparacji) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.
- Pokryj 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych poli-D-lizyną (PDL, 10 μg/ml w PBS) w temperaturze 4°C przez noc. Usuń PDL i spłucz 1,5 m PBS na studzienkę.
- Kontynuować powlekanie płytek lamininą (10 μg/ml w PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przepłukać płytki 1,5 ml PBS na studzienkę.
- Przygotuj pożywkę podtrzymującą neurony DRG, składającą się z pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1% v/v), czynnikiem wzrostu nerwów (NGF, 20 ng/ml) i penicyliną/streptomycyną (P/S, 1% v/v).
- Przygotuj pożywkę do oczyszczania neuronów DRG, składającą się z pożywki neurobazalnej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1%), czynnikiem wzrostu nerwów (NGF, 20 ng / mL), P / S (1%), fluorodeoksyurydyną (FDU, 10 μg / ml) i urydyną (10 μg / ml).
- Uśmiercać ciężarne szczury w 14-15 dniu ciąży przez przedawkowanie pentobarbitalu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowe).
- Ułóż ofiarowane zwierzęta w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch 70% etanolem.
- Przetnij dolną ścianę brzucha zwierzęcia wzdłużnie za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Zidentyfikuj i usuń macicę za pomocą nożyczek do preparowania. Przetnij ścianę macicy, aby odsłonić i usunąć zarodki. Przenieś zarodki do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS. Umieść naczynie hodowlane na lodzie.
- Przenieść zarodek przeznaczony do sekcji do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS (temperatura pokojowa) i umieścić go pod mikroskopem preparacyjnym. Ułóż zarodek w pozycji leżącej.
nuta: Białawy rdzeń kręgowy i przyczepione DRG można zobaczyć nad grzbietową częścią zarodka, przez jego półprzezroczystą skórę.
- Włóż kleszcze do mikropreparowania po obu stronach rdzenia kręgowego i użyj sekcji, aby rozpocząć oddzielanie rdzenia kręgowego od otaczającej tkanki miękkiej. Odetnij rdzeń kręgowy od zwierzęcia za pomocą kleszczy do mikropreparowania wzdłuż otworu szyi i kikuta ogona. Wykonaj dalszą sekcję nad brzuszną częścią rdzenia, aby uwolnić ją od otaczających tkanek miękkich.
- Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby usunąć resztki tkanek miękkich nad grzbietową częścią uwolnionego rdzenia kręgowego.
nuta: Na tym etapie powinien pozostać tylko rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przyczepiony DRG.
- Odłącz poszczególne DRG od łączących je korzeni nerwowych za pomocą kleszczy do mikropreparacji. Użyj pisaka do pipet dołączonego do końcówki o pojemności 1 ml, aby przenieść DRG do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej PBS.
nuta: Na każdą probówkę o pojemności 1,5 ml można umieścić maksymalnie 100 DRG.
- Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w rekombinowanym odczynniku do dysocjacji komórek enzymatycznych (200 μl na probówkę). Inkubować (37 °C, 5% CO2 ) przez 10 min. Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce podtrzymującej neurony DRG. Oddzielić osad przez delikatne rozcieranie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
- Zasiać komórki o gęstości 5,000 komórek/cm2 do 6-dołkowych płytek pokrytych PDL/lamininą w 1,5 ml pożywki podtrzymującej neurony DRG na dołek. Po dwóch dniach hodowli usuń pożywkę podtrzymującą neurony DRG, spłucz PBS i zastąp pożywką do oczyszczania neuronów DRG.
nuta: Dla każdego cyklu oczyszczania należy traktować kultury DRG pożywką oczyszczającą przez 2 dni, a następnie 1 dzień inkubacji w pożywce konserwującej. Po 3-4 cyklach oczyszczania oczekuje się usunięcia wszystkich endogennych komórek glejowych. Powinno to zająć około 14 dni. Oczyszczone kultury dają pozytywny wynik na obecność markera neuronalnego TUJ1 i nie występują w przypadku ekspresji S100β (ryc. 1).
2. Generowanie komórek podobnych do komórek Schwanna
- Przygotować pożywkę do indukcji glejowej składającą się z αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), modyfikacje alfa) uzupełnionej β-hereguliną (100 ng/ml), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 10 ng/ml), płytkopochodnym czynnikiem wzrostu (PDGF-AA, 5 ng/ml), płodową surowicą bydlęcą (FBS, 10%) i P/S (1% v/v).
- Ułóż neurosfery przygotowane w sekcji 4 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL / lamininą o gęstości 5-10 kulek na cm2 w 1,5 ml pożywki do indukcji glejowej na studzienkę. Pożywkę do indukcji glejowej należy wymieniać co 2 dni po przepłukaniu komórek PBS.
- UWAGA: Obserwuje się, że komórki z zasianych neurosfer migrują na zewnątrz do 2 dnia. Do 7 dnia komórki migrujące mają zwężający się wygląd i powinny wykazywać immunopozytywność dla markerów komórek Schwanna receptora neurotrofiny p75 (p75) i S100β7. Komórki te są określane jako SCLC.
3. Kokultura SCLC z neuronami DRG
- Przygotować pożywkę do kohodowli składającą się z pożywki podtrzymującej neurony DRG (krok 1.1.4) i pożywki do indukcji glejowej (etap 1.2.1) w stosunku objętościowym 1:1.
- Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek Schwanna składającą się ze zmodyfikowanej mieszanki Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12)) uzupełnionej FBS (5%), β-hereguliną (10 ng / ml) i P / S (1% v / v).
- Usunąć pożywkę hodowlaną z SCLC dnia 7, przepłukać je PBS i inkubować z 0,5 ml/studzienkę rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić SCLC w pożywce do kokultury.
- Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
- Zasiaj SCLC na oczyszczonych kulturach neuronów DRG o gęstości 1,000 komórek/cm2. Utrzymuj kokultury przez 14 dni, z wymianą pożywki co 2 dni.
nuta: Podczas kohodowli SCLC uzyskały wrzecionowatą morfologię, która jest typowa dla dojrzałych komórek Schwanna (ryc. 2). Komórki te utrzymują się w swoim fenotypie po wycofaniu czynników wzrostu i są zdolne do mielinizacji aksonów in vitro i in vivo. Dodatniość markerów komórek Schwanna (tj. p75 i S100β) powinna być monitorowana za pomocą immunofluorescencji.
- Po zakończeniu kohodowli, przejście losu popełniło komórki Schwanna. Użyj 0,5 ml odczynnika dysocjacyjnego na studzienkę. Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.
