Metoda in vitro do generowania rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych

Streszczenie

Źródło: Katiyar, K. S., et al. Trójwymiarowe sieci astrocytów w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje metodę generowania trójwymiarowych rusztowań astrocytów w mikrokolumnach hydrożelowych. Wnętrze mikrokolumn pokryte jest kolagenem. Wprowadzane są astrocyty, które przylegają do kolagenu i przy dalszej inkubacji samoorganizują się w trójwymiarowe rusztowanie.

Protokół

1. Rozwój mikrokolumn hydrożelu agarozowego

1. Przygotować 3% roztwór agarozy o stężeniu 3% wagowo-objętościowym (w/v), ważąc 3 g agarozy i przenosząc ją do sterylnej zlewki zawierającej 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco. Dodaj sterylny pręt magnetyczny do zlewki i umieść go na powierzchni płyty grzejnej/mieszadła. Zlewkę należy przykryć, aby zapobiec odparowaniu jej zawartości w następnym kroku.
2. Podgrzej agarozę i DPBS w temperaturze 100 °C i mieszaj z prędkością 60-120 obr./min. Dostosuj te ustawienia w razie potrzeby i stale monitoruj postęp procesu rozpuszczania, gdy roztwór początkowo zmienia się z nieprzezroczystego na przezroczysty wygląd, który oznacza, że agaroza została całkowicie rozpuszczona.
   ostrożność: Gorąca zlewka i roztwór są gorące!
3. Gdy roztwór agarozy jest podgrzewany i mieszany, wyjmij cztery puste 10-centymetrowe szalki Petriego i dodaj 20 ml DPBS do dwóch z nich. Umieść igły do akupunktury (średnica: 300 μm, długość: 40 mm), szklane mikrolitrowe rurki kapilarne (średnica: 701,04 μm, długość: 65 mm, pojemność: 25,0 μl) oraz dozownik z żarówką wewnątrz szafki bezpieczeństwa biologicznego. Gdy płynny roztwór agarozy wyklaruje się, należy utrzymywać stałe ogrzewanie w temperaturze około 50 °C i mieszać, aby uniknąć żelowania agarozy.
4. Wprowadź igłę do akupunktury do dolnego otworu dozownika z żarówką. Założyć rurkę kapilarną na igłę wystawioną na zewnątrz. Zabezpiecz rurkę kapilarną, wkładając jej część w gumową część cylindra dozownika bańki.
5. Przenieść 1 ml płynnej agarozy za pomocą mikropipety na powierzchnię pustej szalki Petriego i umieścić jeden koniec rurki kapilarnej pionowo (z włożoną igłą) w kontakcie z agarozą, podczas gdy gumowa nasadka dozownika gruszki jest ściskana do środka. Powoli zwolnij nacisk na nasadkę dozownika żarówki, aby wciągnąć agarozę do rurki kapilarnej.
   nuta: Przenoszenie ciekłej agarozy do kapilar musi być wykonane szybko. Jeśli ciekła agaroza zostanie pozostawiona do ostygnięcia na powierzchni szalki Petriego przez wystarczająco długi czas (około 60 s), zaczyna żelować, uniemożliwiając odpowiednie zasysanie agarozy wzdłuż rurki kapilarnej.
6. Umieść każdy zespół bańka-rurka-igła na wolnej szalce Petriego i pozwól, aby żel agarozowy wewnątrz kapilar zestalił się na 5 minut. Ostrożnie wyciągnij rurkę kapilarną rękami z gumowego korka w cylindrze dozownika bańki, pozostawiając igłę i żel agarozowy na miejscu wewnątrz probówki.
7. Ręcznie wyjmij igłę do akupunktury, powoli wyciągając ją z rurki kapilarnej; nowo zestalony cylinder agarozy również wysuwa się z rurki w tej procedurze, nadal otaczając igłę. Delikatnie popchnij mikrokolumnę wzdłuż igły do akupunktury końcówką sterylnych kleszczyków, aby przesunąć ją do końca. Umieść igłę na otwartej szalce Petriego zawierającej DPBS i wepchnij mikrokolumnę do DPBS za pomocą kleszczy.
   nuta: Jeśli mikrokolumna agarozy pozostanie w szklanej rurce kapilarnej po wyjęciu igły do akupunktury, powoli wypchnij mikrokolumnę agarozy z rurki kapilarnej za pomocą igły o średnicy 25 mm do naczynia z DPBS.
8. Sterylizuj mikroskalpele lub kleszcze za pomocą sterylizatora z gorącymi kulkami. Przygotuj 4% w/v agarozy, ważąc 4 g agarozy i przenosząc ją do 100 ml DPBS. Podgrzej i wymieszaj, jak wyjaśniono w kroku 1.2, aby uzyskać klarowny 4% płynny roztwór agarozy. Utrzymuj podgrzewanie i mieszanie roztworu w kolejnych krokach.
9. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny do okapu preparacyjnego i przenieść mikrokolumnę za pomocą drobnych kleszczyków na pustą szalkę Petriego. Wykorzystaj stereoskop do wskazówek wizualnych i mikroskalpel, aby przyciąć mikrokolumny na żądaną długość. Przytnij oba końce, aby utworzyć skośne końce pod kątem 45^o od poziomu, aby ułatwić obsługę mikrokolumn podczas macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i dodawania komórek.
10. Powtórz poprzedni krok dla trzech kolejnych mikrokolumn na tej samej szalce Petriego i ustaw cztery konstrukcje równolegle z odstępem <3 mm między każdym z cylindrów. Załadować 50 μl 4% roztworu agarozy za pomocą mikropipety i wlać smugę/linię cieczy na układ mikrokolumn, aby połączyć i związać konstrukty w grupy po cztery (zwane dalej "łodziami mikrokolumnowymi"). Unikaj przemieszczania się 4% agarozy na końce mikrokolumn, które mogą zatkać wnętrze, minimalizując odległość między konstrukcjami i szybko dodając agarozę cienką linią.
    nuta: Układanie grup czterech mikrokolumn w "łodzie" nie jest wymagane do wytworzenia rusztowań astrocytowych. Niemniej jednak łodzie służą przyspieszeniu procesu produkcji i oferują bezpieczniejszy sposób przenoszenia i obsługi mikrokolumn w późniejszych etapach.
11. Pozwól łodzi z mikrokolumną ostygnąć przez 1-2 minuty, aby umożliwić żelowanie dodanych 4% agarozy. Podnieś łódkę z mikrokolumnami za pomocą drobnych kleszczy, łącząc 4% agarozy, a następnie przenieś mikrokolumny na drugą płytkę Petriego zawierającą DPBS, przygotowaną w kroku 1.1.3. Wyprodukuj więcej łodzi z pozostałymi mikrokolumnami zgodnie z potrzebami.
12. Przenieść szalki Petriego zawierające mikrokolumny i/lub łódeczki do komory bezpieczeństwa biologicznego i sterylizować pod wpływem światła ultrafioletowego (UV) przez 30 minut
    ostrożność: Nosić odpowiednią ochronę, aby zapobiec ekspozycji na promieniowanie UV.
13. Przechowywać szalki z łódeczkami z mikrokolumnami w DPBS w temperaturze 4 °C, jeżeli dodanie ECM i posiew komórek nie nastąpią bezpośrednio po tym, przez okres do 1 tygodnia. Powtórz kroki produkcji mikrokolumn, jeśli konstrukcje nie są używane w tym czasie.

2. Pierwotna hodowla komórkowa i izolacja

1. Izolacja astrocytów korowych od młodych szczurów
   1. Przygotowując się do kolejnych kroków, dodaj 20 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do czterech 10-centymetrowych szalek Petriego, które posłużą jako zbiorniki dla wypreparowanych tkanek. Trzymaj wszystkie naczynia na lodzie. Sterylizuj czyste nożyczki chirurgiczne, kleszcze, mikroszpatułki i mikroskalpele w sterylizatorze z gorącymi kulkami.
   2. Rozgrzej 0,25% trypsynę z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 0,15 mg/ml dezoksyrybonukleazy (DNazy) I w HBSS w temperaturze 37 °C. Ponadto należy podgrzać pożywkę do hodowli astrocytów w temperaturze 37 °C, która składa się ze zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynki i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   3. Znieczulenie szczeniąt szczurów Sprague-Dawley po urodzeniu 0 lub 1 dni, wystawiając je na warunki hipotermiczne i eutanazję przez dekapitację. Przypnij głowę do etapu za pomocą igły o średnicy 19 mm umieszczonej w pysku przed oczami.
   4. Wykonaj nacięcie skalpelem od środka od tyłu do przodu, od podstawy szyi do tuż za oczami. Wykonaj kolejne nacięcie idąc bocznie od bezpośrednio za oczami w dół, tworząc kształt litery T. Użyj cienkich kleszczy, aby odciągnąć skórę czaszki/czaszkę na bok.
   5. Trzymaj głowę za pysk (skierowaną do góry), umieszczając jeden ząb kleszczy w pysku zwierzęcia, a drugi na zewnętrznej powierzchni. Usuń mózg za pomocą sterylnej mikroszpatułki i umieść go na jednej z szalek Petriego wypełnionych schłodzonym HBSS. Umieść tę szalkę Petriego na lodzie natychmiast po tym i przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest używana.
   6. Umieść blok granitowy przechowywany wcześniej w temperaturze -20 °C poniżej stereoskopu wewnątrz okapu preparacyjnego. Umieść szalkę Petriego z tkanką mózgową na powierzchni bloku granitowego, aby zachować jego niską temperaturę podczas procedury preparacji. Użyj stereoskopu jako wizualnej wskazówki w kolejnych krokach.
   7. Jeśli opuszki węchowe pozostają nienaruszone, usuń je przez cięcie kleszczami lub mikroskalpelami. Ponadto za pomocą mikroskalpela usuń móżdżek i wykonaj nacięcie w linii środkowej oddzielające dwie półkule mózgowe. Przenieś półkule za pomocą kleszczy na szalkę Petriego zawierającą świeży, schłodzony HBSS.
   8. Wypreparuj struktury śródmózgowia od wnętrza półkul za pomocą mikroskalpela, aby uzyskać tylko oddzielone kory. Użyj cienkich kleszczy, aby oderwać opony mózgowe, strukturę przypominającą prześcieradło, od tkanki korowej i przenieść izolowaną korę na nową szalkę Petriego z zimnym HBSS. Użyj mikroskalpela, aby zmielić tkankę, aby w następnym kroku zwiększyć powierzchnię działania trypsyny.
   9. Za pomocą pipety Pasteura przenieś korę do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA (8 korek w każdej probówce). Wystawić tkankę korową na działanie trypsyny-EDTA przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C.
   10. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usunąć trypsynę-EDTA i dodać 400 μl 0,15 mg/ml roztworu DNAzy I do probówki wirówkowej. Mieszaj probówkę lub wir, aż cała tkanka zostanie zdysocjowana i w płynie nie pozostaną żadne kawałki tkanki. Jeśli nie jest możliwe całkowite rozpuszczenie tkanki, usuń pozostałe fragmenty końcówką pipety Pasteura.
   11. Odwirować probówkę zawierającą zdysocjowany roztwór komórek o sile 200 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant za pomocą pipety Pasteura, nie naruszając komórek. Dodać 1 ml pożywki do hodowli astrocytów (określonej w kroku 2.1.2) do probówki za pomocą mikropipety i zamieszać w celu ponownego zawieszenia i wytworzenia jednorodnego roztworu.
   12. Przenieść 10 ml pożywki do hodowli astrocytów za pomocą pipety serologicznej do kolby T-75. Dodać 250 μl 1 ml roztworu komórek (przygotowanego w kroku 2.1.11) za pomocą mikropipety do kolby, aby umieścić na kolbie komórki o wartości jednego mózgu młodego. Rozprowadzić rozładowany roztwór komórkowy równomiernie na pożywce hodowlanej i delikatnie poruszyć kolbę, aby jeszcze bardziej ułatwić równomierne rozprowadzenie.
   13. Wyhodować kolby posiane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Po osiągnięciu 24 i 72 godzin w hodowli należy mechanicznie wymieszać kolbę w celu odłączenia nieprzylegających typów komórek, takich jak neurony i oligodendrocyty.
   14. Następnie w każdym z tych punktów czasowych wykonaj zmianę nośnika. Trzymać kolbę pionowo, tak aby pożywka hodowlana leżała na dnie kolby, nie zakrywając przylegających komórek. Odessać pożywkę hodowlaną pipetą Pasteura, dociskając końcówkę pipety do dolnego rogu kolby, aby uniknąć ekstrakcji komórek. Umieścić kolbę w pierwotnym położeniu poziomym i delikatnie dodać 10 ml pożywki astrocytowej na komórki za pomocą pipety serologicznej.
   15. Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze po każdej zmianie pożywki. Po osiągnięciu 90% zbieżności należy ponownie mechanicznie wymieszać kolbę, aby usunąć wszelkie pozostałe nieprzylegające komórki.
   16. Przepasuj astrocyty, wyjmując pożywkę hodowlaną za pomocą próżni i pipety Pasteura. Dodać 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA za pomocą pipety serologicznej na przylegające komórki. Delikatnie wymieszać kolbę, aby upewnić się, że trypsyna pokrywa wszystkie komórki, i inkubować kolbę przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   17. Ugasić trypsynę, dodając 1 ml pożywki astrocytów do komórek za pomocą pipety serologicznej. Ekstrahować roztwór komórek z kolby za pomocą pipety serologicznej i przenieść go do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 3 minuty.
   18. Usunąć supernatant za pomocą pipety serologicznej i ponownie zawiesić go w 1 ml pożywki do hodowli astrocytów. Poruszyć probówkę, aby upewnić się, że roztwór komórkowy jest jednorodny. Policz liczbę komórek w roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
       nuta: Kolba, która jest w 90% zlewająca, zwykle daje około 3 milionów astrocytów.
   19. Dodać 10 ml pożywki do hodowli astrocytów do kolby T-75. Przeprowadzić rozcieńczenie w stosunku 1:4, przenosząc 250 μl roztworu komórkowego (etap 2.1.18) za pomocą mikropipety do kolby T-75 zawierającej już pożywkę hodowlaną. Delikatnie wymieszać, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie komórek na całej powierzchni kolby.
   20. Powtórz kroki 2.1.16-2.1.19 za każdym razem, gdy zostanie osiągnięta 90% zbieżność w celu przejścia komórek.
2. Izolacja neuronów korowych od płodów szczurów
   1. Postępuj zgodnie z podobnymi przygotowaniami, jak w krokach 2.1.1 i 2.1.2, z wyjątkiem tego, że wstępnie podgrzaną pożywką jest pożywka kohodowlana, składająca się z pożywki neuropodstawowej + 2% suplementu B-27 (dla neuronów) + 1% suplementu bez surowicy G-5 (dla astrocytów) + 0,25% L-glutaminy.
   2. Eutanazja zarodków w ciąży w czasie 18 dnia Sprague-Dawley szczurów z uduszeniem dwutlenkiem węgla i potwierdź śmierć przez ścięcie.
   3. Wyodrębnij płody szczurów i wypreparuj korę z reszty tkanki mózgowej na szalkach Petriego zawierających HBSS na powierzchni schłodzonego bloku granitowego, używając stereoskopu do wizualnej orientacji i wysterylizowanych nożyczek, mikroskalpela i kleszczy. Po kolejnym rozebraniu głów, mózgów, półkul mózgowych i kory mózgowej, przenieś każdą tkankę na nową szalkę Petriego wypełnioną HBSS.
   4. Zmiel tkankę korową na mniejsze fragmenty, aby zwiększyć powierzchnię trypsyny. Przenieść 4-6 kory mózgowej za pomocą pipety Pasteura do probówki z 5 ml wstępnie podgrzanej trypsyny-EDTA i utrzymywać w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji tkanki. Po 5-7 minutach ręcznie wymieszaj probówkę, aby wymieszać i zapobiec zbrylaniu się tkanki.
   5. Wyjmij probówkę z 37 °C po 10 minutach. Jak wyjaśniono wcześniej w kroku 2.1, wyekstrahuj trypsynę-EDTA i zastąp ją 1,8 ml roztworu DNAzy o stężeniu 0,15 mg/mL. Następnie wiruj tkankę, aż roztwór stanie się jednorodny, bez fragmentów tkanki unoszących się w płynie.
   6. Odwirować zdysocjowany roztwór tkankowy o stężeniu 200 x g przez 3 minuty. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić w 2 ml pożywki do współhodowli. Policz liczbę komórek w tym roztworze za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
      nuta: Zwykła wydajność wynosi 3,0-5,0 x 10⁶ komórek / półkulę korową.
   7. Przygotować nowy roztwór komórkowy o gęstości 2,0-4,0 x 10⁵ komórek/ml w pożywkach do kohodowli określonych powyżej.

3. Rozwój astrocytarnych wewnątrz mikrokolumn

1. Produkcja rdzenia ECM
   UWAGA: ECM musi zostać dodany do wnętrza mikrokolumn hydrożelowych w tym samym dniu, w którym zostanie przeprowadzone wysiewanie komórek.
   1. Wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego przygotuj 1 mg/ml roztwór kolagenu typu I z ogona szczura w pożywce do kohodowli w sterylnej probówce do mikrowirówki. Probówkę do mikrowirówki z roztworem ECM należy utrzymywać na lodzie przez cały czas, z wyjątkiem sytuacji, gdy jest ona używana.
   2. Przenieść 1-2 μl roztworu ECM za pomocą mikropipety na pasek papierka lakmusowego, aby oszacować jego pH. Dodać 1 μl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) lub kwasu solnego (HCl) za pomocą mikropipety, aby odpowiednio zwiększyć lub zmniejszyć pH roztworu ECM, a następnie pipetować w górę i w dół do homogenizacji. Sprawdź nowe pH za pomocą paska papierka lakmusowego i dodaj więcej kwasu lub zasady, w zależności od potrzeb, aż pH ustabilizuje się w zakresie 7,2-7,4.
   3. Przenieść szalki Petriego z kroku 1.2 do okapu preparacyjnego i przenieść 4-5 mikrokolumn lub łódkę ze sterylnymi drobnymi kleszczami na pustą, sterylną szalkę Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Korzystając ze stereoskopu jako wskazówki, umieść końcówkę mikropipety o pojemności 10 μl na jednym końcu każdej mikrokolumny i odsysaj, aby opróżnić światło DPBS i pęcherzyki powietrza. Potwierdź brak pęcherzyków powietrza za pomocą stereoskopu, aby upewnić się, że ECM dodany w następnym kroku może swobodnie przepływać przez światło.
   4. Napełnij mikropipetę P10 roztworem ECM, przyłóż końcówkę o pojemności 10 μl do jednego końca mikrokolumn hydrożelowych i dostarcz roztwór wystarczający do wypełnienia światła (około 3-5 μl), obserwując wejście ECM za pomocą stereoskopu. Odpipetować mały zbiornik (2-4 μl) roztworu ECM na obu końcach mikrokolumny.
      nuta: Zawsze zarządzaj 4-5 mikrokolumnami lub jedną łodzią na raz, aby zapobiec długotrwałemu wysychaniu konstrukcji, ponieważ może to spowodować zgniecenie struktury mikrokolumny. Całkowicie wysuszone mikrokolumny mocno przylegają do powierzchni szalek Petriego, co uniemożliwia ich wykorzystanie do wysiewu komórek. Nadmierne ilości pożywek do kokultur (jako środek hydratacji) nie mogą być dodawane do mikrokolumn, ponieważ może to spowodować wypływ ECM podczas okresu inkubacji opisanego poniżej.
   5. Odpipetować pożywki do współhodowli w pierścieniu wokół szalki Petriego, aby zapewnić zlewozmywak, aby zapobiec wysychaniu kolumn podczas inkubacji. Inkubować szalkę Petriego zawierającą mikrokolumny zawierające ECM w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę w celu pobudzenia polimeryzacji kolagenu przed dodaniem neuronów i/lub astrocytów.
      nuta: ECM powinien tworzyć warstwę pokrywającą wewnętrzną powierzchnię pustego światła, a nie solidny rdzeń ECM obejmujący wnętrze, z których oba można obserwować za pomocą stereoskopu. Jeśli ECM tworzy rdzeń, kontynuuj okres inkubacji, aż pozostanie tylko warstwa. Po utworzeniu tej warstwy roztwór komórek astrocytów może wypełnić wnętrze mikrokolumny na etapach posiewu.
   6. W okresie inkubacji należy przygotować roztwór komórek astrocytów (jak opisano poniżej).
2. Wysiewanie astrocytów i neuronów w mikrokolumnach
   1. Przejść przez platerowane astrocyty (między czwartym a dwunastym pasażem), jak wyjaśniono w krokach 2.1.16-2.1.19. Po zliczeniu liczby komórek w kolbie przygotować roztwór komórek o gęstości 9,0-12,0 x 10⁵ komórek/ml roztwór zawieszony w pożywce do hodowli komórkowych.
   2. Za pomocą stereoskopu umieść końcówkę mikropipety P10 na jednym końcu mikrokolumn i przenieś wystarczającą ilość roztworu komórkowego (~5 μl) do światła, aby całkowicie go wypełnić. Podobnie jak w przypadku ECM, dodaj małe zbiorniki roztworu komórkowego na obu końcach każdej mikrokolumny.
   3. Inkubować posiane mikrokolumny na szalkach Petriego w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 1 godzinę, aby ułatwić przyłączenie astrocytów do ECM. Jeśli neurony nie zostaną dodane do mikrokolumn, przejdź do kroku 3.2.5.
   4. Po początkowym okresie inkubacji dodać 1-2 μl roztworu neuronu korowego otrzymanego w kroku 2.2.7 do obu końców mikrokolumn za pomocą mikropipety, obserwując pod stereoskopem. Upewnij się, że w naczyniach znajduje się wystarczająca ilość pożywki, aby uniknąć wysuszenia, i ponownie inkubować przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ , aby umożliwić adhezję neuronów.
      nuta: Roztwór neuronu korowego można również dodać 1-2 dni po utworzeniu pęczka Hisa, wykonując krok 3.2.4 po ostrożnym usunięciu pożywki hodowlanej z szalki Petriego za pomocą mikropipety.
   5. Po okresie inkubacji ostrożnie napełnić szalki Petriego zawierające posiane mikrokolumny 3 lub 6 ml pożywki do współhodowli odpowiednio na szalki Petriego o średnicy 35 lub 60 mm. Utrzymuj platerowane mikrokolumny w kulturze w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aby ułatwić samoorganizację wyrównanych wiązek astrocytów, które po 6-10 godzinach powinny utworzyć wiązkę, przypominającą strukturę.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła do akupunktury (średnica 300 μm)	Medycyna w Lhasie	HS.30x40	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru światła mikrokolumny.
szalka Petriego	rybak	Numer katalogowy: 08772B
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polistyrenowa jednorazowa pipeta serologiczna	rybak	13-678-11D
Agarozy	Sigma	A9539-50G
Szklana rurka kapilarna o mikrolitrach (701 μm)	rybak	21-170J	Średnica może być zmieniana w zależności od pożądanego rozmiaru powłoki mikrokolumny.
Dozownik do bańek z mikronasadką	rybak	21-170J	Żarówka jest dostarczana z rurkami z mikronasadką.
Płyta grzejna	rybak	SP88857200
Listwa magnetyczna	rybak	1451352
Mikropipeta	Sigma	Z683884-1EA
Igła o średnicy 25 mm	rybak	14-826-49
Mikroskalpel	Roboz Chirurgiczny	Złącze RS-6270
nożyczki	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14081-09
Kleszcze	Światowe instrumenty precyzyjne	501985
Sterylizator gorących kulek	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N
Mikroszpatułka	rybak	S50821
Kolagen ze szczurzego ogona typu I	Corning	354236	Utrzymywać w temperaturze 4 ºC i usuwać tylko w razie potrzeby. Używaj lodu, aby utrzymać jego temperaturę podczas użytkowania.
Probówka do mikrowirówek	rybak	Numer katalogowy: 02-681-256
Wodorotlenek sodu (NaOH)	rybak	Zobacz materiał SS2661
Kwas solny (HCl)	rybak	Zobacz materiał SA48-1
Papierek lakmusowy	rybak	09-876-18
Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)	Invitrogen	14170112	Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
0,25% trypsyna-EDTA	Invitrogen	25200056	Przed użyciem przechowywać w temperaturze -20 ºC i w cieple w temperaturze 37 ºC.
Deoksyrybonukleaza (Dnaza) bydlęca trzustka I	Sigma	10104159001	Przed użyciem przechowywać w temperaturze -20 ºC i w cieple w temperaturze 37 ºC.
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z mieszanką składników odżywczych F-12 szynki	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11330-032	Przechowywać w temperaturze 4 ºC.
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Przechowywać w temperaturze -20ºC.
Dzień po porodzie 0 lub dzień 1 Szczenięta szczura Sprague Dawley	Rzeka Karola	Szczep 001
Neuron neuropodstawowy neuron embrionalny podłoże	Invitrogen	21103049	Przed użyciem przechowywać w temperaturze 4ºC i ogrzewać w temperaturze 37ºC.
B-27 suplement bez surowicy	Invitrogen	12587010	Przed użyciem przechowywać w temperaturze -20 ºC i w cieple w temperaturze 37 ºC.
L-glutamina	Invitrogen	35050061	Przed użyciem przechowywać w temperaturze -20 ºC i w cieple w temperaturze 37 ºC.
Suplement astrocytarny G5	Invitrogen	17503012
Szczury embrionalne Sprague Dawley 18 dni	Rzeka Karola	Szczep 001
Pipeta Pasteura	rybak	Numer katalogowy: 22-042816
Probówka wirówkowa 15 ml	Targi EMESCO	Numer katalogowy: 1194-352099
wir	rybak	Numer katalogowy: 02-215-414
wirówka	rybak	Numer katalogowy: 05-413-115
Hemocytometr	rybak	Numer katalogowy: 02-671-6
inkubator	rybak	13 998 076