$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie rusztowania jedwabnego
- Przygotowanie roztworu jedwabiu z kokonów Bombyx mori
- Pokrój każdy kokon na 8 równych kawałków za pomocą nożyczek. Użyj około 11 kokonów na 5 g rozdrobnionych kokonów. (Czas trwania: 15 min)
- Przygotować 2 l roztworu 0,02 M Na2CO3 i zagotować na płycie grzejnej. (Czas trwania: 15 min)
- Odważyć 5 g rozdrobnionych kokonów i gotować je w roztworze Na2CO3 przez 30 min. Mieszaj wrzący jedwab co kilka minut szpatułką. Ten etap, zwany odgumowywaniem, oczyszcza fibroinę jedwabiu z hydrofilowych białek, serycyn. (Czas trwania: 30 min)
- Wykręć fibroinę ręcznie i opłucz ją w wodzie destylowanej co najmniej trzy razy, aby wypłukać pozostałą serycynę i chemikalia. (Czas trwania: 5 min)
- Umieść mokrą fibroinę na szalce Petriego i wysusz ekstrakt z fibroiny w okapie przepływowym O/N.
- Następnego dnia zważ suchą masę fibroiny i umieść ją w szklanej zlewce. (Czas trwania: 15 min)
- Aby rozpuścić fibroinę w 9,3 M roztworze LiBr, należy obliczyć wymaganą objętość (w ml) LiBr, mnożąc masę suchej fibroiny przez 4. Powoli wlej roztwór LiBr na fibroinę jedwabiu i za pomocą szpatułki zanurz wszystkie włókna fibroiny. Przykryj zlewkę, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w temperaturze 60 °C na 4 godziny, aby włókna mogły się rozpuścić. (Czas trwania: 15 min)
- Za pomocą strzykawki pobrać roztwór fibroiny ze zlewki i załadować go do kaset do dializy MWCO 3,500. Wykonuj dializę z wodą destylowaną przez 48 godzin. Zmieniaj wodę co kilka godzin.
- Za pomocą strzykawki zebrać roztwór fibroiny z kaset do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i dwukrotnie odwirować przy 9 000 obr./min (~12 700 x g) w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Po każdym etapie wirowania wlać supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. (Czas trwania: 40 min)
- Zmierz stężenie fibroiny, szacując suchą masę. Wlej 1 ml roztworu jedwabiu do łódki wagowej. Suszyć próbkę w suszarce w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Zważyć suchą fibroinę jedwabiu i obliczyć stężenie roztworu fibroiny jedwabiu, mnożąc uzyskaną masę przez 100. Oczekiwane stężenie roztworu jedwabiu wynosi 6-9% (w/v).
- Dostosuj stężenie jedwabiu do 6% (w/v), rozcieńczając go w wodzie destylowanej.
Punkt zatrzymania: Płynna fibroina jedwabiu może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca w zamkniętym pojemniku.
- Przygotowanie porowatych rusztowań z roztworu jedwabiu.
- Przesiej granulowany NaCl, aby oddzielić granulki o wielkości 500-600 μm, które zostaną wykorzystane w późniejszych etapach. Granulki o wielkości poniżej 500 μm i powyżej 600 μm należy wyrzucić. (15 min)
- Wlać 30 ml 6% roztworu jedwabiu do formy z politetrafluoroetylenu (PTFE) (rysunek 1). Delikatnie rozsyp 60 g przesianego NaCl na jedwabiu. Postukaj w pojemnik, aby uzyskać jednolitą warstwę soli. Inkubować 48 godzin w temperaturze pokojowej w celu polimeryzacji jedwabiu.
- Umieścić formę PTFE zawierającą rusztowanie w piecu w temperaturze 60 °C na 1 godzinę, aby zakończyć polimeryzację i odparować pozostałą ciecz
.
- Umieść zawartość formy z PTFE w zlewce zawierającej 2 litry wody destylowanej na 48 godzin, aby wypłukać sól. Zmieniaj wodę 2-3 razy dziennie. Usuń rusztowania gąbkowe z form, gdy sól zostanie całkowicie wypłukana.
Punkt zatrzymania: Gąbki można przechowywać zanurzone w wodzie o temperaturze 4 °C w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec odwodnieniu rusztowań.
- Wytnij rusztowania za pomocą stempla do biopsji o średnicy 5 mm, gdy będą gotowe. Rusztowania należy wstępnie przyciąć tak, aby osiągnęły około 2 mm wysokości. Przebić środek rusztowania za pomocą stempla do biopsji o średnicy 2 mm (ryc. 2A). (1 godz.)
- Autoklawuj rusztowania zanurzone w wodzie w celu ich sterylizacji (cykl mokry, 121 °C, 20 min).
Punkt zatrzymania: Gąbki można przechowywać zanurzone w wodzie o temperaturze 4 °C w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec odwodnieniu rusztowań.
- Przed planowanym wysiewem komórek należy zanurzyć rusztowania w sterylnym roztworze poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 0,1 mg/ml. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Przemyć rusztowania 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia niezwiązanego PDL. (Czas trwania: 30 min)
2. Izolacja neuronów kory mózgowej szczura
- Wypreparować korę mózgową szczurów Sprague-Dawley w 18. dniu embrionalnym (E18) po uzyskaniu zatwierdzonego protokołu zwierzęcego. (2 godz.)
- Inkubować 10 kory mózgowej w 5 ml 0,25% trypsyny z 0,3% DNazą I (z trzustki bydlęcej) przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
- Dezaktywuj trypsynę, dodając 1 mg/ml białka sojowego.
- Przeprowadzić rozcieranie kory mózgowej za pomocą pipety Pasteura o pojemności 10 ml, pipetując w górę i w dół 20 razy, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Zachowaj delikatność i unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. (Czas trwania: 10 min)
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 127 x g przez 5 min.
- Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej (pożywka neuropodstawna, 1x suplement B27, 1x Glutamax, 1% penicylina/streptomycyna). Policz komórki. Oczekiwane stężenie komórek wynosi około 2x107/ml. (20 min)
3. Zbuduj zgromadzenie i kulturę
- Siew rusztowań z komórkami
- Przenieś sterylne rusztowania i wszystkie wymagane przybory do wnętrza okapu do hodowli komórkowych. Umieść rusztowania na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej za pomocą sterylnych kleszczy, przydzielając jedno rusztowanie na studzienkę. (Czas trwania: 10 min)
- Zanurz rusztowania w pożywce do hodowli komórkowych, aby je zrównoważyć przed wysiewem komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. (10 min)
- Odessać nadmiar pożywki z rusztowań.
- Zastosować 100 μl zawiesiny komórek/rusztowania. (Czas trwania: 10 min)
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C O/N, aby umożliwić przyłączenie komórek do rusztowania.
- Następnego ranka odessać nieprzyłączone komórki i zastosować 200 μl/studzienkę świeżej pożywki hodowlanej. (Czas trwania: 10 min)
- Rusztowanie zatopione matrycą kolagenową. (2 godz.)
- Umieść 10x PBS, wodę, 1 N NaOH i kolagen szczura i ogon szczura I na lodzie. Przygotuj roztwór roboczy kolagenu zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj na lodzie, aż konstrukty z nasion komórek będą gotowe (do 1 godziny).
- Usunąć z inkubatora jedwabne konstrukty z nasionami komórek i odessać nadmiar pożywki.
- Przenieść rusztowania do pustych studzienek na płytce studzienki za pomocą sterylnych kleszczy i zanurzyć każde rusztowanie w 100 μl roztworu kolagenu o stężeniu 3 mg/ml. Umieść płytkę do hodowli tkankowej z powrotem w inkubatorze na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
- Zastosować 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża do hodowli komórkowych. Hoduj konstrukty przez tydzień, zmieniając pożywkę codziennie, wymieniając tylko połowę objętości pożywki.
