Replikacja zróżnicowanych neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Calabrese, B. et al., Post-differentiation Replating of human pluripotent stem cell derived neurons for high-content screening of Neuritogenesis and Synapse Maturation. J. Vis. Exp. (2019)

Film prezentuje metodę oddzielania i ponownego sadzenia ludzkich pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych za pomocą łagodnego enzymu proteolitycznego. Po filtracji i odwirowaniu neurony są ponownie powlekane na powlekanej płytce wielodołkowej w celu inkubacji, co sprzyja przyczepianiu i dojrzewaniu.

Protokół

1. Okres różnicowania przed powtórzeniem

1. Różnicuj neurony na 10-centymetrowych szalkach, używając wybranego protokołu, aż neurony utworzą grubą sieć ze swoimi procesami i wyrażą nie tylko wczesne markery neuronalne, takie jak MAP2 lub TuJ1, ale także późne markery, takie jak NeuN.
2. Zmieniaj połowę wybranej pożywki co 4 dni podczas procesu różnicowania neuronów.
   nuta: Bardziej rozległe lub częste zmiany podłoża rozcieńczają istotne czynniki troficzne i mogą niekorzystnie wpływać na dojrzewanie.
   1. W przypadku neuronów WT126 pochodzących z iPSC należy użyć następujących pożywek do hodowli po różnicowaniu: 5 ml 100x suplementu N2 (neuronowego), 10 ng / ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF), 10 ng / ml czynnika neurotroficznego pochodzącego z linii komórek glejowych (GDNF), 1 μg / ml lamininy, 200 μM kwasu askorbinowego, 1 μM dibutyryl-cAMP i 10 ml SM1 dla 500 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle's Eagle's F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12). Stopniowo, stosując zmiany półpożywki, zastąp je podstawowym podłożem neuronalnym (Tabela materiałów) i tymi samymi suplementami.
   2. W przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub neuronów CVB WT pochodzących z iPSC należy użyć następującej pożywki do hodowli po różnicowaniu: 500 ml neuronalnej podstawowej pożywki A (tabela materiałów) i 500 ml pożywki DMEM/F12 z 2 μg/ml lamininy, 10 ml suplementu glutaminy (tabela materiałów), 0,75 mg/ml wodorowęglanu sodu, 5 ml minimalnej pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 0,2 mM kwasu askorbinowego, 10 ng/ml BDNF, 20 ml 50x B27 i 10 ml 100x suplementu N2.

2. Powłoka Multiwells

1. Dzień przed ponownym poszyciem pokryć poli-L-ornityną (PLO). Rozpuścić PLO w sterylnej wodzie, aby uzyskać roztwór podstawowy (10 mg/ml). Przechowuj ten bulion w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć PLO w stosunku 1:100 w wodzie, aby uzyskać stężenie 50 μg/ml podczas powlekania szkła i w stosunku 1:1 000 (10 μg/ml) podczas powlekania tworzywa sztucznego.
2. Powłokę należy nakładać bezpośrednio na płyty docelowe. Użyć objętości powłoki odpowiedniej do wielkości płytki (tj. w przypadku płytki 24-dołkowej należy zastosować 500 μl roztworu PLO na dołek).
3. Pozostaw talerze na noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
4. Pobrać powlekane płytki w dniu ponownego powlekania i przenieść do sterylnej komory bezpieczeństwa biologicznego.
5. Zassać roztwór PLO i spłukać dwukrotnie sterylną wodą.
6. Rozcieńczyć lamininę (1,15 mg/ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w rozcieńczeniu 1:400.
   nuta: Rozmrozić lamininę w temperaturze 4 °C i szybko dodać do PBS, aby uniknąć agregacji lamininy i nierównomiernego powlekania.
7. Odessać sterylną wodę i nałożyć 500 μl powłoki lamininowej na studzienki uprzednio pokryte PLO.
8. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na minimum 4-6 godzin. W przypadku powierzchni szklanych należy stosować dłuższe inkubacje, do 16 godzin. Stosuj stałe czasy inkubacji.

3. Odtwarzanie zróżnicowanych neuronów

1. Raz delikatnie przepłucz płytkę zróżnicowanych neuronów PBS. Delikatnie rozprowadź PBS wzdłuż ścianki płytki, a nie bezpośrednio na komórkach, aby uniknąć ich zakłócenia.
2. Delikatnie zasysaj PBS, uważając, aby nie dotykać komórek bezpośrednio, ale odsysać od krawędzi naczynia, przechylając je w kierunku badacza.
3. Nałożyć co najmniej 1 ml enzymu proteolitycznego (tabela materiałów) na płytkę o średnicy 10 cm i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze. Dodaj nieco większe objętości, jeśli pomieszczenie do hodowli tkankowej wykazuje wysoką szybkość parowania z powodu niskiej wilgotności.
4. Inkubuj komórki enzymem proteolitycznym przez 40-45 minut, aby oderwać je od płytki i oderwać od innych neuronów w sieci neuronalnej.
   nuta: Czas na tym etapie ma kluczowe znaczenie. Zbyt wczesne wygaszenie proteazy może prowadzić do zwiększonej śmierci komórki po ponownym posianiu. Producent enzymu proteolitycznego zaleca, aby w przypadku pasażowania linii komórkowych (np. przez noc w temperaturze 4 °C stosować temperatury znacznie niższe niż 37 °C przy dłuższych okresach inkubacji). Należy jednak unikać obchodzenia się z neuronami w temperaturze 4 °C, ponieważ często wykazują one słabą przeżywalność po ekspozycji na zimno. Producent podaje również, że 60-minutowa inkubacja z enzymem w temperaturze 37 °C prowadzi do jego enzymatycznej inaktywacji. Jednak z doświadczenia autorów wynika, że 40-45 minutowa inkubacja kultur neuronalnych pochodzących z hiPSC w temperaturze 37 °C jest wystarczająca do skutecznej dysocjacji i doskonałego przeżycia neuronów po ponownym posianiu.
5. Sprawdź neurony pod mikroskopem z kontrastem fazowym w czasie inkubacji i pozwól na kontynuowanie leczenia proteazą, dopóki sieć neuronowa całkowicie nie odłączy się od płytki i nie zacznie rozpadać się na mniejsze arkusze po krótkim potrząśnięciu płytką pod mikroskopem.
6. Stłumić aktywność proteazy za pomocą 5 ml świeżej pożywki DMEM na 1 ml proteazy na 10 cm płytce, aby zatrzymać trawienie. Delikatnie rozcieraj komórki o płytkę 5-8 razy, aby zakłócić sieć, używając pipet serologicznych. Uważaj, aby nie wywierać zbyt dużego nacisku podczas trituringu, ponieważ zróżnicowane neurony są delikatne. Nie używaj końcówki P1000, ponieważ jej koniec jest zbyt ostry i wąski, a tym samym może prześwitywać lub uszkodzić neurony.
7. Roztwór z komórkami należy nakładać kropla po kropli przez sitko o średnicy 100 μm do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
8. Przepłucz sitko dodatkowymi 5 ml świeżej pożywki DMEM, po przefiltrowaniu komórek.
9. Wirować komórki w wirówce stołowej o sile 1 000 x g przez 5 minut.
10. Włóż stożkową rurkę z powrotem do szafy bezpieczeństwa biologicznego i odessaj większość pożywki, pozostawiając około 250 μl, aby zapewnić komórkom zatrzymanie wilgoci.
11. Delikatnie zawieś komórki w 2 ml świeżej pożywki DMEM. Nie pipetować granulki do boku probówki. Zamiast tego delikatnie odwróć stożkową rurkę 2-3 razy i przepuść komórki przez koniec pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby je usunąć.
12. Nałóż 10 μl zawieszonych neuronów na krawędź hemocytometru.
13. Dodać 8-10 μl błękitu trypanowego do kropli komórek, aby ocenić żywotność komórek podczas tego etapu ponownego zawieszania. Nanieść 10 μl tej mieszaniny na hemocytometr lub inne automatyczne liczniki komórek. Oceń jako żywotne te komórki, które są jasne fazowo i wykluczają barwnik błękitu trypanowego.
14. Określ ilość żywotnych komórek/ml i przygotuj się do rozcieńczenia zawartości stożkowej probówki zgodnie z pożądaną gęstością komórek.
15. Płytka ~ 10 000 komórek na dołek dla płytki 384-dołkowej; płytka ~ 150 000-200 000 komórek na studzienkę dla płytki 24-dołkowej.
16. Dodać świeży DMEM do stożkowej probówki z zawieszonymi komórkami, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie i dodać dodatkowe odpowiednie suplementy, takie jak B27 i/lub BDNF, w zależności od wymagań konkretnej linii komórkowej.
17. Delikatnie przechyl stożkową rurkę, aby wymieszać 2-3 razy.
18. Odessać powłokę lamininy z płytki 24-dołkowej lub z płytki wielodołkowej 384-dołkowej za pomocą pipety 16-kanałowej i raz spłukać PBS.
19. Zassać PBS za pomocą P1000 w przypadku płytki 24-dołkowej lub pipety 16-kanałowej w przypadku płytek 384-dołkowych.
20. Nałóż roztwór komórkowy na każdą studzienkę ruchem ósemkowym, aby uniknąć zbrylania. Jednorodność posiewu można również zoptymalizować za pomocą zautomatyzowanych urządzeń do obsługi cieczy.
    nuta: Dodanie lamininy do pożywki rozpoczynające się 2-4 dni po ponownym posiewie pomaga również w utrzymaniu jednorodnego rozmieszczenia komórek.
21. Powtórz kroki 3.19 i 3.20 dla każdej studzienki.
22. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
23. Po 2 dniach należy rozpocząć wymianę połowy pożywki co 4 dni, używając pożywek do hodowli po różnicowaniu opisanych w punkcie 1.2.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas L-askorbinowy	Sigma	Nr kat. A4403	Dodaj 1 ml bulionu 200 mM do 1 l pożywki N2B27
dibutyryl-cAMP	Sigma	Zobacz materiał D0627	Dodać 1 μM
Ludzki BDNF	Peprotech	Rozdział 450-02	Stężenie końcowe 10 ng/ml
B27 (50X)	Thermofisher Naukowy	17504044	Dodać 20 ml do 1 l pożywki N2B27
DMEM/F12 z Glutamaxem	Thermofisher Naukowy	31331093	Dodać N2 i rozprowadzić w 50 ml stożkowych pokrywkach; pokrywki do owijania parafilmów
Ludzki GDNF	Peprotech	450-10	Stężenie końcowe 10 ng/ml
Glutamax (Glutamax)	Thermofisher Naukowy	35050038	Dodać 10 ml do 1L pożywki N2B27; suplement glutaminy
Mysz Laminin	Sigma	P3655-10mg w skolmie	Dodać 100 μl do 50 ml N2B27
MEM Aminokwasy endogenne	Thermofisher Naukowy	11140035	Dodaj 5 ml do 1 l pożywki N2B27
Suplement N2 (100X)	Technologie życiowe	17502048	Dodaj 5 ml do 500 ml podłoża
Neuropodstawowy A Media	Thermofisher Naukowy	10888022	Połącz z DMEM / F12, aby wygenerować pożywkę N2B27 dla komórek CVB wt; neuronalne podłoże podstawowe A
Podłoże nerwowo-podstawne	Thermofisher Naukowy	21103049	dla komórek WT126; neuronalne podłoże podstawowe
Suplement SM1	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 5711	Dodaj 1:50 do multimediów
Wodorowęglan sodu	Thermofisher Naukowy	25080-094	Dodaj 10 ml do 1 l pożywki N2B27
Przygotowanie talerza
10 cm naczynia do hodowli tkankowych	Fisher Naukowy	08772-E	Naczynia z tworzywa sztucznego poddane obróbce TC
6-dołkowe naczynia do hodowli tkankowych	Thomas Naukowy	1194Y80	Talerze NEST
Mysz Laminin	Technologie życiowe	23017-015	Dodaj 1:400 na plastiku
Poliornityna	v	P3655-10mg w skolmie	Dodaj 1:1000 na plastiku
Ultraczysta woda destylowana	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10977-015	Do rozcieńczania poli-L-ornityny
Odczynniki do ponownego reagowania
Filtr siatkowy 100mM	Corning	431752	Sterylne, pakowane pojedynczo
Płytka 384-dołkowa, niepowlekana	PerkinElmer powiedział:	6007550	Płaszcz z PLO i Lamininą
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Technologie życiowe	14190144	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco
Płytki 384-dołkowe powlekane poli-D-lizyną	PerkinElmer powiedział:	Numer katalogowy: 6057500	Spłucz przed pokryciem lamininą