$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wytwarzanie form SU-8 metodą fotolitografii
UWAGA: Ta procedura dotyczy niebezpiecznych substancji chemicznych. Przez cały czas używaj dygestorium i środków ochrony osobistej.
- Oczyść płytkę silikonową (o średnicy 4 cali, grubości 1 mm, polerowanej) acetonem i przedmuchaj gazowym azotem. Następnie piecz w temperaturze 180 °C przez 3 minuty do wyschnięcia.
- Dozować 3 ml SU-8 2100 na oczyszczoną płytkę.
- Pokryć SU-8 równomiernie na płytce za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 500 obr./min przez 10 s, a następnie kolejno wirować z prędkością 1500 obr./min przez 30 s z przyspieszeniem 300 obr./s, aby uzyskać warstwę SU-8.
o grubości 150 μm
UWAGA: Upewnij się, że płytka krzemowa jest umieszczona na środku powlekarki wirowej i prawidłowo zamocowana za pomocą próżni.
- Wafel pieczemy na miękko na płycie grzejnej w temperaturze 50 °C przez 10 minut, w temperaturze 65 °C przez 7 minut, a w temperaturze 95 °C przez 45 minut.
- Ustaw fotomaskę (Rysunek 1) na wyrównywaczu maski i naświetlaj światło UV (365 nm) przez 60 s.
UWAGA: Czas ekspozycji musi być zoptymalizowany przez odpowiednią dawkę światła UV.
- Po ekspozycji piecz wafel w temperaturze 65 °C przez 6 minut, a w temperaturze 95 °C przez 13 minut na płycie grzejnej.
- Rozwijaj płytkę przez 10-20 minut w wywoływaczu SU-8 z mieszaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej, zmieniając roztwór wywoływania raz w trakcie procesu.
UWAGA: Wydłuż czas wywoływania, gdy pozostaną szczątki SU-8.
- Opłucz wafel w izopropanolu i delikatnie osusz wafel gazowym azotem.
- Zmierz wysokość osadzonego SU-8 za pomocą mikroskopu pomiarowego i upewnij się, że ma grubość około 150 μm. Może być przechowywany w nieskończoność w temperaturze pokojowej.
2. Wytwarzanie mikroprzepływowych chipów do hodowli tkankowych na bazie polidimetylosiloksanu (PDMS)
- Przymocuj wafel osadzony na SU-8 do pojemnika (np. plastikowej szalki Petriego o średnicy 15 cm) za pomocą taśmy dwustronnej.
- Zdmuchnij kurz z płytki za pomocą gazowego azotu.
- Aby sylizanizować należy umieścić wafel osadzony w SU-8 w komorze próżniowej wraz z małym pojemnikiem (np. szalką 35 mm). Wrzuć 10 μl (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu do małego pojemnika. Nie stosować bezpośrednio (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylo)-1-trichlorosilanu do płytki SU-8.
- Zamknij szczelnie komorę próżniową i włącz pompę próżniową na co najmniej 2 godziny.
- Weź plastikowy kubek i wlej elastomer silikonowy (np. Silpot 184 lub odpowiednik Sylgard 184) i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1. Następnie dobrze wymieszaj za pomocą szpatułki i odgazuj w komorze próżniowej, aż pęcherzyki zostaną całkowicie usunięte.
- Wlej mieszaninę PDMS do pojemnika z waflem SU-8 do żądanej grubości (3-4 mm) i ponownie odgazuj w celu usunięcia pęcherzyków.
- Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 3 godziny, aby w pełni utwardzić PDMS.
- Po schłodzeniu odciąć utwardzony PDMS od wafla za pomocą skalpela lub żyletki.
- Aby utworzyć dwie komory chipa do hodowli tkankowej, przebij dwa otwory, w których znajdują się dwie komory, za pomocą stempla do biopsji o średnicy 1,5 mm.
- Aby utworzyć zbiornik pożywki, należy przygotować kolejną mieszaninę PDMS (elastomer silikonowy i utwardzacz w stosunku wagowym 10:1) i wlać ją do nowej szalki Petriego o średnicy 10 cm. Dostosuj objętość nalewania do 5 mm grubości PDMS.
- Piecz PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez co najmniej 3 godziny, aby w pełni utwardzić PDMS.
- Po schłodzeniu PDMS odetnij utwardzony PDMS skalpelem, aby uzyskać prostokątny pierścień.
- Połącz dolną warstwę ze zbiornikiem pożywki, nakładając między nie nieutwardzony PDMS i wypalając zmontowane warstwy PDMS. Ta powiązana struktura skutkuje powstaniem chipa do hodowli tkankowej PDMS.
- Wyczyść chip do hodowli tkankowej PDMS za pomocą taśmy klejącej, aby usunąć kurz i małe cząstki z powierzchni. Chipy do hodowli tkankowych PDMS mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej, jeśli są chronione przed kurzem i promieniowaniem UV.
3. Przygotowanie kultury
- Pożywka hodowlana
nuta: Wszystkie pożywki wymienione poniżej należy przefiltrować w celu sterylizacji, chyba że zaznaczono inaczej. Przygotowane podłoża można przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu miesiąca.
- Aby przygotować pożywkę mTeSR Plus: połączyć jedną butelkę 100 ml suplementu mTeSR Plus 5x z jedną butelką 400 ml pożywki mTeSR Plus Basal Medium.
- Aby przygotować 100 ml pożywki KSR: W 85 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium lub DMEM/F12 dodaj 15 ml zamiennika surowicy Knockout (KSR, 15%), 1 ml komercyjnego suplementu glutaminy (1%) i 1 ml aminokwasu endogennego (NEAA, 1%).
- Aby przygotować 100 ml pożywki N2: W 100 ml pożywki Neurobasel dodaj 1 ml N2 (100x), 1 ml komercyjnego suplementu glutaminy i 1 ml NEAA.
- Aby przygotować 250 ml pożywki do dojrzewania: W 250 ml pożywki Neurobasel dodaj 5 ml witaminy B27 (2%), 2,5 ml dostępnego w handlu suplementu glutaminy (1%) i 2,5 ml penicyliny/streptomycyny (1%).
- Zawiesić związki (kwas retinowy (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) w DMSO klasy hodowli komórkowej do pożądanego stężenia. Przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy. Stosowane są następujące roztwory podstawowe: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Powłoka
nuta: Aby zapobiec polimeryzacji matrycy błony podstawnej pod wpływem ciepła, należy unikać powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli to możliwe, wszystkie procedury powlekania należy wykonywać za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek pipet i probówek. Matrycę błony podstawnej należy rozmrażać przez noc w temperaturze 4 °C i porcjować za pomocą wstępnie schłodzonych końcówek i rurek do pipet. Podwielokrotności można zamrażać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
- Zamrożoną porcję rozmrozić w temperaturze 4°C na lodzie. Podwielokrotność powinna być przechowywana w niskiej temperaturze podczas procedury powlekania. Za pomocą wstępnie schłodzonej końcówki pipety rozcieńczyć matrycę membrany podstawnej lodowatym DMEM/F12 w stosunku 1:40. Niewykorzystaną rozcieńczoną matrycę membrany podstawnej można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni, pod warunkiem, że nie nastąpiła polimeryzacja.
- Dodać 1 ml matrycy błony podstawnej/roztworu DMEM-F12, aby pokryć jedną studzienkę płytki 6-dołkowej.
- Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej godzinę lub 4 °C przez noc. Powlekane talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez tydzień.
4. Utrzymanie komórek iPS
- Przygotuj naczynia pokryte matrycą z membraną podstawną, jak wspomniano wcześniej w kroku 3.2.
- W pełni zassać pożywkę mTeSR Plus. Umyj studzienkę raz PBS i dodaj 0,5 ml odczynnika do pasażowania (patrz Tabela materiałów). Odczekaj kilka sekund i odessaj roztwór.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki staną się okrągłe.
nuta: Czas inkubacji może się różnić w zależności od różnych linii komórkowych iPS i konfluencji. Należy okresowo sprawdzać pod mikroskopem, aby określić czas dysocjacji podczas inkubacji.
- Dodaj 1 ml pożywki mTeSR Plus i postukaj w płytkę przez 30-60 s, aby oderwać kolonie.
- Delikatnie wymieszać 1 ml roztworu zawiesiny komórkowej z 7 ml świeżego mTeSR plus pożywka. Nie pipetować więcej niż 5 razy.
- Talerz w stosunku 1:8. Zazwyczaj dodaje się 1 ml zawiesiny z kroku 5.5 i dodaje 1 ml mTeSR plus pożywkę uzupełnioną 5-10 μM Y-27632 (inhibitor ROCK). Współczynnik rozcieńczenia pasażu zależy od linii iPSC.
- Umieścić komórkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO2/37 °C. Następnego dnia usuń Y-27632, dodając świeżą pożywkę mTeSR Plus. Następnie zmieniaj pożywkę początkowo co drugi dzień i codziennie, gdy komórka osiągnie większą konfluencję.
5. Różnicowanie komórek iPS w neurony ruchowe
- Pasażowanie iPSC do różnicowania neuronów ruchowych
nuta: Różnicowanie może być z powodzeniem prowadzone w protokole 3D (5.2).
- Pozwól niezróżnicowanym komórkom iPS rosnąć, aż osiągną konfluencję około 80% w pożywce mTeSR Plus na płytce 6-dołkowej.
- Całkowicie zassać pożywkę. Natychmiast umyj studzienkę sterylnym PBS i dodaj 0,5 ml roztworu dysocjacji komórek do komórek.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez około 2-3 minuty lub do momentu, gdy komórki rozdzielą się i zaokrąglą, ale pozostaną połączone ze studzienką.
- Dodać 1 ml pożywki i delikatnie pipetować kilka razy w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml składającej się z 4 ml pożywki.
- Wirować przy 200 x g przez 3 min.
- Ostrożnie odessać supernatant, pozostawiając osad w nienaruszonym stanie, i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki uzupełnionej 10 μM Y-27632.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i przejdź do 5,2 (różnicowanie 3D).
- Tworzenie sferoidy neuronu ruchowego (MNS) w różnicowaniu 3D ("protokół 3D")
nuta: Całkowita zmiana pożywki jest wykonywana codziennie od 0 do 12 dni różnicowania (ryc. 2).
- Zasiaj komórki iPS z kroku 5.1.7 na 96-dołkowej dolnej płytce U przy 40 000 komórek / dołku w 100 μL mTeSR Plus uzupełnionym 10 μM Y-27632.
- Następnego dnia zastąp każdą studzienkę 100 μl świeżej pożywki.
- W dniach 0 i 1: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl pożywki KSR (3.1.2) uzupełnionej 10 μM SB431542 i 100 nM LDN-193189.
- W dniach 2 i 3: Odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl pożywki KSR uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
- W dniu 4 i 5: Przygotować mieszaną pożywkę składającą się z 75% pożywki KSR i 25% pożywki N2 (3.1.3). Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
- W dniach 6 i 7: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 50% pożywki KSR i 50% pożywki N2. Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić ją 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM kwasu retinowego i 1 μM SAG.
- W dniach 8 i 9: Przygotuj mieszaną pożywkę składającą się z 25% pożywki KSR i 75% pożywki N2. Następnie odessać pożywkę hodowlaną i zastąpić 100 μl mieszanej pożywki uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
- W dniach 10 i 11: Zastąp pożywkę 100 μl pożywki N2 uzupełnionej 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA i 1 μM SAG.
- W dniu 12: Przystąp do przeniesienia MN do chipa do hodowli tkankowej (krok 6) lub zastąp pożywkę 100 μl pożywki dojrzewającej (3.1.4) uzupełnionej 20 ng/ml neurotroficznego czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF).
nuta: MNS można przenieść do chipa do hodowli tkankowej od 12 do 19 dnia. Sferoidy, które nie są przenoszone, powinny być hodowane na 96-dołkowych płytkach dolnych U w pożywce do dojrzewania uzupełnionej 20 ng / ml BDNF do czasu przeniesienia.
6. Przygotowanie chipa do hodowli tkankowej do tworzenia organoidów nerwów ruchowych (MNO)
- Wysterylizuj przygotowany PDMS (z kroku 2.13), zanurzając go w 70% etanolu na szalce Petriego na co najmniej 1 godzinę
nuta: Wszystkie poniższe kroki powinny być manipulowane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
- Wysterylizuj szkło mikroskopu (76 x 52 mm), zanurzając je w 70% etanolu na szalce Petriego.
- Podczas procesu suszenia szkła mikroskopowego umieść urządzenie PDMS na połowie mokrym szkle mikroskopu i pozostaw do całkowitego wyschnięcia, czekając przez noc. Po całkowitym wyschnięciu urządzenie PDMS powinno przylegać do szkła.
nuta: To połączenie nie jest trwałe, aby umożliwić odłączenie urządzeń PDMS od szkła mikroskopu po hodowli w celu pobrania tkanki. Trwałe wiązanie za pomocą plazmy tlenowej może być stosowane w celu maksymalizacji przyczepności między PDMS a szkłem, ale uniemożliwiłoby to demontaż chipów i pobieranie tkanek.
- Pokryj powierzchnię mikrokanalika w urządzeniu PDMS i szkle mikroskopu 30 μl rozcieńczonej matrycy membrany podstawnej w DMEM/F12 (1:40), tworząc kroplę po jednej stronie wlotu kanału, a następnie odessać roztwór z drugiej strony wlotu za pomocą pipety lub pompy ssącej (rysunek 3A). Nie zasysaj zbyt dużej objętości roztworu, aby uniknąć zanieczyszczenia pęcherzykami.
- Następnie inkubować urządzenie PDMS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C w pojemniku wtórnym (np. na szalce Petriego).
7. Tworzenie organoidów nerwów ruchowych (MNO)
- Zastąp roztwór powlekający wstępnie podgrzanym 150 μl pożywki do dojrzewania uzupełnionej 20 ng/ml BDNF tuż przed użyciem.
- Następnie umieść MNS z kroku 5.2.9 na wlocie mikrokanału za pomocą mikropipety z końcówką o szerokim otworze. MNS może samoistnie osiąść na dnie urządzenia pod wpływem grawitacji. Nie należy wywierać zbyt dużego nacisku podczas wstrzykiwania MNS (Rysunek 3B).
nuta: Jeśli MNS utknął na bocznej ścianie otworu w chipie do hodowli tkankowej, delikatnie zassaj roztwór z drugiej strony wlotu.
- Napełnij mały zbiornik (np. nakrętkę z probówką o pojemności 15 ml) sterylną wodą i umieść go w pobliżu chipa do hodowli tkankowej w pojemniku wtórnym, aby zapobiec parowaniu pożywki. Następnie umieść go w inkubatorze o stężeniu 5% CO2/37 °C.
- W celu zmiany pożywki należy zassać wyczerpaną pożywkę hodowlaną ze środka zbiornika pożywki (rysunek 3C). Nie odsysać całego podłoża i tkanki.
- Delikatnie dodaj świeżą pożywkę do dojrzewania (z BDNF). Pożywkę należy zmieniać co 2-3 dni. Nie suszyć pożywki hodowlanej w żadnym momencie podczas hodowli. Aksony rosną z MNS do kanału i spontanicznie łączą się w pojedynczy wiązkę w ciągu 2-3 tygodni, co prowadzi do powstania MNO. MNO może być hodowany w urządzeniu przez ponad 1 dodatkowy miesiąc.
