1. Hodowle komórkowe i predyferencjacja
- Hodowla nerwowych komórek macierzystych i preróżnicowanie
- Przygotować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną. Umieścić sterylne szkiełko nakrywkowe (o średnicy 20 mm) na płytkę 12-dołkową. Pokryj szkło nakrywkowe poli-D-lizyną 0,1% w/v w wodzie, aby uzyskać lepszą przyczepność komórek do szkiełek nakrywkowych, wykonując następujące czynności.
UWAGA: Dla każdej linii komórkowej i aplikacji należy określić optymalne warunki.
- Aseptycznie pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego poli-D-lizyną o stężeniu 0,1% w/v w wodzie. Kołysz delikatnie, aby zapewnić równomierne pokrycie powierzchni szkiełka nakrywkowego.
- Po nocnym hodowaniu (~12 h) w temperaturze 37°C należy usunąć roztwór poli-D-lizyny i spłukać powierzchnię 3x 1 ml sterylnej wody.
- Wysuszyć komórki co najmniej 30 minut przed ich wysiewem.
- Hodowla mysich nerwowych komórek macierzystych C17.2 (C17.2-NSC) i preróżnicowanie
- Inkubować C17.2-NSC w kolbie o średnicy 25cm2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5% surowicą końską (HS) i 1% penicyliną/streptomycyną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 dla ~2 - 3d.
- Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, usuń pożywkę, umyj komórki 1 ml PBS i dodaj 1 ml świeżej trypsyny (0,25%) do kolby. Pozostaw na 1 minutę; następnie dodać 1 ml pożywki hodowlanej do kolby i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Policz gęstość komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Obliczyć wymaganą objętość zawiesiny komórek, aby uzyskać końcowe stężenie komórek 2 x 104 komórek/ml.
- Zasiać C17.2-NSC na powlekanych szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowej płytce o gęstości ~2 x 104 komórek na studzienkę. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem.
UWAGA: Aby uzyskać lepszy wynik, przed eksperymentem immunofluorescencyjnym należy określić optymalną gęstość komórek.
- Inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze komórkowym przez 12 godzin, aby umożliwić przyłączenie.
- Po przyłączeniu przemyć komórki 2x 1 ml PBS i hodować komórki za pomocą pożywki różnicującej składającej się z DMEM/F12 z 1% suplementem N2 przez 48 godzin przed obróbką osocza.
- Pierwotna hodowla nerwowych komórek macierzystych szczura i preróżnicowanie
- Hodowla pierwotnej zawiesiny NSC (nerwowych komórek macierzystych) szczura w pożywce wzrostowej NSC szczura w niepowlekanych kolbach T25 o gęstości 5 x 105 komórek.
- Sprawdź powstawanie neurosfer pod odwróconym mikroskopem. Upewnij się, że morfologia neurosfer wykazuje kuliste i przezroczyste kompleksy wielokomórkowe.
- Gdy neurosfery osiągną średnicę 3 mm lub większą, przenieś zawiesinę neurosfery do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie.
- Ostrożnie usunąć supernatant, aby pozostawić neurosfery w minimalnej objętości pożywki.
- Przepłucz neurosfery 1x 5 ml PBS i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie. Usunąć supernatant, aby pozostawić minimalną objętość PBS.
- Dodaj odpowiednią objętość pożywki różnicującej, aby dostosować gęstość komórek do ~12 - 15 neurosfer na mililitr. Pożywka różnicująca dla pierwotnych NSC szczurów składa się z DMEM/F12, 2% B27 i 1% FBS.
- Umieść 1 ml zawiesiny neurosfery na każdym powlekanym szkiełku nakrywkowym na płytce 12-dołkowej.
UWAGA: Delikatnie potrząśnij płytką, aby upewnić się, że neurosfery są równomiernie rozłożone. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla uzyskania lepszego wyniku immunofluorescencji.
- Umieścić płytkę w inkubatorze i pozostawić do wstępnego różnicowania przez 24 godziny przed obróbką plazmową.
2. Przygotowanie dżetów plazmowych
- Wybierz półotwartą rurkę kwarcową o średnicy wewnętrznej 2 mm i średnicy zewnętrznej 4 mm. Włóż do rurki przewód wysokiego napięcia o średnicy 2 mm.
- Włóż rurkę kwarcową z przewodem wysokiego napięcia do strzykawki o pojemności 5 ml i użyj uchwytu, aby zamontować ją wewnątrz środka strzykawki. Ustaw odległość między uszczelnionym końcem rurki kwarcowej a końcówką strzykawki na 1 cm.
- Podłączyć rurkę z gumy silikonowej o długości 1 m (o średnicy wewnętrznej 12 mm) do otwartego końca strzykawki, a następnie podłączyć ją kolejno do przepływomierza i zaworu gazowego.
3. Przejęcie Jets
- Podłącz obwód, jak pokazano na rysunku 1. Podłącz przewód wyjściowy zasilacza do urządzenia plazmowego, a następnie połącz końcówkę sondy wysokonapięciowej z przewodem wyjściowym, aby wykryć napięcie. Podłącz drugi koniec sondy wysokonapięciowej do oscyloskopu, aby zarejestrować informacje o napięciu wyjściowym. Sprawdź cały obwód i upewnij się, że zasilacz, oscyloskop i sonda wysokiego napięcia są uziemione.
- Sprawdź przewód gazowy. Upewnij się, że rura gazowa została podłączona do urządzenia do strumienia plazmy; następnie otwórz zawór gazowy helu (ułamek objętościowy, 99,999%) i tlenu (ułamek objętościowy, 99,999%) i ustaw przepływ gazu na 1 L : 0,01 l / min (He:O2).
UWAGA: Pozwól gazowi płynąć przez kilka minut przed pierwszym włączeniem zasilania.
- Ustaw amplitudę, częstotliwość i szerokość impulsu odpowiednio na 8 kV, 8 kHz i 1600 ns. Sprawdź ponownie obwód, a następnie włącz przycisk wyjścia, aby utworzyć strumień plazmy.
UWAGA: Nigdy nie dotykaj przewodu wysokiego napięcia.
4. Plazmowe leczenie nerwowych komórek macierzystych
- Ustaw odległość między dyszą strzykawki a otworem w komorze na 15 mm.
UWAGA: Odległość jest mierzona od dołu platformy, na której umieszczona jest płytka 12-dołkowa.
- Wyjąć 12-dołkową płytkę z inkubatora i zmienić pożywkę z wstępnie zróżnicowanych komórek na 800 μl świeżej pożywki różnicującej.
- Podziel komórki na trzy grupy: nieleczoną grupę kontrolną, grupę leczoną przepływem gazu He-and-O2 (1%) przez 60 s i grupę leczoną osoczem 60 s.
UWAGA: Nie ma oczywistej utraty płynów w warunkach zabiegu.
- Umieść 12-dołkową płytkę pod dyszami plazmy, upewnij się, że dysza strzykawki jest zamocowana na środku każdego otworu i poddaj odpowiednią obróbkę różnym grupom wymienionym w kroku 4.3.
UWAGA: Niepoddane działaniu substancji kontrolnej trzymano w pożywce różnicującej w temperaturze pokojowej podczas procedury eksperymentalnej, aby zapewnić jednolite warunki leczenia. Grupa leczona przepływem gazu He-and-O2 (1%) była traktowana tylko przepływem gazu He i O2 (1%), bez wytwarzania plazmy. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.
5. Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych
- Po poddaniu działaniu substancji należy usunąć oryginalną kulturę i dodać 1 ml nowej pożywki różnicującej do każdej studzienki.
- Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2 przez 6 dni. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
- Codziennie sprawdzaj stan różnicowania różnych grup pod mikroskopem światła z odwróconym kontrastem fazowym Rysunek 2. Losowo wybierz co najmniej 12 pól i zrób zdjęcia, aby zarejestrować zmiany morfologiczne.
