Generowanie prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Streszczenie

Źródło: Tischfield, D. J., et al Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film przedstawia metodę generowania prekursorów interneuronów korowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Protokół zakłada hodowlę komórek macierzystych w pożywkach zawierających specyficzne inhibitory małocząsteczkowe, które ułatwiają proliferację i agregację komórek macierzystych w ciała zarodkowe (EB). Następnie EB są dysocjowane z enzymami i siane na płytkach hodowlanych pokrytych białkami adhezyjnymi, aby promować ich różnicowanie w prekursory interneuronów korowych.

Protokół

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Podgrzej wszystkie media do 37 ° C przed użyciem w hodowli komórkowej.

1. Pożywka z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) (do przygotowania 500 ml)
   1. Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do 449 ml zmodyfikowanej pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porów.
   2. Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowywać media w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca lub podwielokrotności i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.
2. Pożywka N2 (do przygotowania 500 ml)
   1. Dodaj 5 ml L-alaniny-L-glutaminy (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 489,5 ml DMEM: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12) i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porów.
   2. Dodać 1 ml środka przeciwdrobnoustrojowego (50 mg/ml) i 5 ml suplementu N2 B po filtracji. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca.
3. Pożywka bez surowicy (KSR) (do przygotowania 500 ml)
   1. Dodaj 75 ml pożywki bez surowicy, 5 ml L-glutaminy (100x), 5 ml aminokwasów endogennych MEM (MEM-NEAA) (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 413,5 ml DMEM zawierającej glutaminę i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porowego.
   2. Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
4. Pożywka z embrionalnych komórek macierzystych myszy (do przygotowania 500 ml)
   1. Dodaj 75 ml FBS komórek macierzystych, 5 ml MEM-NEAA (100x), 5 ml L-glutaminy (100x) i 500 μl 2-merkaptoetanolu (55 mM) do 413,5 ml DMEM zawierającego nieglutaminę i przefiltruj przez 500 ml 0,22 μm filtra porowego.
   2. Dodać 1 ml środka przeciwbakteryjnego (50 mg/ml) po filtracji. Przechowywać nośniki w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do 1 miesiąca lub porcji i przechowywać w temperaturze ≤ -20 °C.

2. Hodowla mESC

1. Płytka mitotycznie nieaktywnych komórek zasilających MEF w pożywkach MEF na płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych w odległości 3-4 x 10⁴ komórek/cm². Przed posiewem mESC należy odczekać co najmniej 12 godzin, aby osiadły w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze ≥37 °C, przy wilgotności względnej 95 % i 5 % CO₂ . Jeśli nie zostanie natychmiast użyty, wymieniaj nośnik MEF co 3 dni. MEF, jeśli nie zostaną użyte, należy usunąć w ciągu 7 dni od poszycia.
2. Dodaj mESC (zakres gęstości od 1-4 x 10⁴ komórek/^cm2) do płytek MEF w pożywkach mESC zawierających czynnik hamujący białaczkę myszy (mLIF) (1,000 U/ml). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5%_CO2.
3. Przejście mESC za pomocą trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny) (1:5-1:10), gdy naczynie stanie się ~ 70-80% zlewające się lub jeśli kolonie zaczną się stykać. Zwykle odbywa się to co 2 dni, ale może potrwać do 4 lub 5 dni, w zależności od początkowej gęstości poszycia.
4. Utrzymuj mESC na warstwie zasilającej MEF w pożywce mESC, aby utrzymać pluripotencję.
5. Przed rozpoczęciem różnicowania należy przynajmniej raz przenieść komórki na płytki pokryte żelatyną bez MEF, aby rozcieńczyć MEF.​
   1. Przygotować płytki pokryte żelatyną, dodając 0,1% żelatyny do buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) z Ca²⁺/Mg²⁺ do naczynia poddanego działaniu kultur tkankowych i pozostawiając w temperaturze 37 °C na co najmniej 1 godzinę. Płytka 1,5-2 x 10 6 komórek/10 cm płytka (2,7-3,6 x 10⁴ komórki/cm²) i pozostawić komórki do ekspansji przez 2 dni przed rozpoczęciem różnicowania.

3. Różnicowanie mESC w kierunku progenitorów kresomózgowia podobnego do MGE

1. Dzień różnicowania (DD) 0 = "komórki zmiennoprzecinkowe"
   1. Po tym, jak mESC będą rosły na płytkach pokrytych żelatyną przez 2 dni, odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS bez Ca^{2 +} / Mg^{2 +}. Dodać tyle trypsyny-EDTA (0,05% trypsyny), aby pokryć powierzchnię płytki (zwykle 4 ml trypsyny-EDTA na jedno 10-centymetrowe naczynie do hodowli tkankowej) i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥95% i 5% CO₂ przez 4 minuty.
   2. Po 4 minutach wygasić trypsynę-EDTA, używając 2-krotności objętości za pomocą pożywki mESC. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o odpowiedniej wielkości i odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Po 5 minutach wyjmij probówkę i zassaj pożywkę, nie naruszając osadu. Zawiesić osad w 1 ml pożywki KSR:N2 (1:1) zawierającej inhibitor BMP LDN-193189 (250 nM) i inhibitor Wnt XAV-939 (10 μM).
   3. Zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozpocznij hodowlę komórek jako ciał zarodkowych (EB), dodając 75 000 komórek/ml w pożywce KSR:N2 (1:1) zawierającej LDN-193189 (250 nM) i XAV-939 (10 μM) w nieprzylegających naczyniach do hodowli tkankowych. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5%_CO2.
2. W przypadku DD1 przygotuj się do "lądowania" komórki, pokrywając naczynia poddane kulturze tkankowej poli-L-lizyną (10 μg/ml w PBS z Ca²⁺/Mg²⁺) przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% lub przez co najmniej 1 godzinę.
3. W przypadku DD2 odessać poli-L-lizynę i pokryć płytki lamininą (10 μg/ml w PBS z Ca²⁺/Mg²⁺) O/N w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95%.
   nuta: Chociaż O/N jest optymalny, wystarczy zaledwie 2 godziny. Jeśli płytki nie zostaną zużyte do następnego dnia, odessać lamininę, zastąpić PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺ i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
4. DD3 ("komórki lądowe")
   1. Przed rozpoczęciem dysocjacji EB należy odessać lamininę i pozostawić płytki do całkowitego wyschnięcia w kapturze do hodowli tkankowej. Nie używaj talerzy, które wydają się błyszczące lub widocznie mokre. Przenieś EB z pożywką do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przez 3-4 minuty przy 15 x g lub do momentu, gdy EB się zagnieżdżą.
5. Odessać pożywkę i dodać 3 ml roztworu do oddzielania komórek zawierającego DNazę (2 U/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przy wilgotności względnej ≥ 95% i 5% CO₂ przez 15 minut. Delikatnie przesuwaj probówkę co 3 minuty, aby wspomóc dysocjację EB.
6. Gdy EB przestaną być widoczne lub upłynęło 15 minut, dodać 6 ml KSR:N2 (1:1) zawierającego DNazę (1 U/ml) i wirować przez 5 minut przy 200 x g.
7. Umieść komórki w KSR:N2 (1:1) zawierającym LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) i inhibitor ROCK Y-27632 (10 μM) w proporcji 4,5-5 x 10⁴ komórki/cm².

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mysie fibroblasty embrionalne (CF-1, MEF, IRR, 7M)	MTI-Globalstem	GSC-6101G	1 fiolka 7M MEF wystarcza na cztery 10-centymetrowe płytki TC.
FBS (Sieć Usługowa	Atlanta Biologicals	S11150H
Primocin	Szczepionka Invivogen	Ant-pm-2	Znany również jako środek przeciwdrobnoustrojowy. Nie filtrować z mediami bazowymi - dodać po filtracji.
Suplement N2-B	Technologie komórek macierzystych	Numer katalogowy: 7156	Nie filtruj z mediami bazowymi - dodaj po filtracji
Glutamax (100x)	Rybak termiczny	35050061	Znana również jako L-alanina-L-glutamina.
Wymiana surowicy KnockOut (KSR)	Rybak termiczny	10828028	Znany również jako średni suplement bez surowicy.
L-glutamina (100x)	Rybak termiczny	25030081
MEM-NEAA (100x)	Rybak termiczny	11140050
2-merkaptoetanol	Rybak termiczny	21985023
Nokaut DMEM	Rybak termiczny	10829018
Hydrokon FBS	Firma VWR	82013-578	Znany również jako FBS klasy komórek macierzystych.
Naczynie do hodowli tkankowej (10 cm)	BD Sokół	353003
Nieprzywierająca sterylna szalka Petriego (10 cm)	Firma VWR	25384-342
Czynnik hamujący białaczkę (mLIF)	Chemik	ESG1107	Nie zamrażać, przechowywać w temperaturze 4'C.
DMEM/F12	Rybak termiczny	11330032
0,1% roztwór żelatyny	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC PCS-999-027
Laminina	Sigma	L2020
Poli-L-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P6282
Trypsyna-EDTA (0,05%)	Rybak termiczny	25300054
Dokładności	Rybak termiczny	A1110501	Znany również jako odczynnik dysocjacji komórek niezawierający trypsyny.
RQ1 DNaza wolna od RNaz	Preparat Promega	Zobacz materiał M610A
Numer identyfikacyjny LDN-193189	Stemgent (Łodyga	04-1974	Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych porcjach
XAV939	Stemgent (Łodyga	04-1946	Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych porcjach
Inhibitor ROCK (Y-27632)	Tocris powiedział:	1254	Zawiesić w DMSO i przechowywać w temperaturze -80'C w jednorazowych porcjach