Generowanie progenitorów nerwowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy metodą wiszącej kropli

Streszczenie

Źródło: Hanafiah, A., et al. Różnicowanie i charakterystyka progenitorów nerwowych i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy. J. Vis. Exp. (2020).

Film pokazuje różnicowanie się embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC) do ciał embrionalnych (EB) metodą wiszącej kropli. Po zawieszeniu mESC w wiszących kroplach i inkubacji, komórki agregują się, tworząc EB, które są dalej różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą pożywki różnicującej uzupełnionej kwasem retinowym (RA).

Protokół

1. Kultura mESC

1. Pokryj 10-centymetrową płytkę poddaną kulturze tkankowej 0,1% żelatyny i pozostaw żelatynę do zastygnięcia na co najmniej 15–30 minut przed jej odessaniem.
2. Napromieniowane γ nasiona mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) na dzień przed hodowlą mESC we wstępnie podgrzanej pożywce mESC (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS), aminokwasami endogennymi, β-merkaptoetanolem, L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną, pirogronianem sodu, czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), PD0325901 (PD) i CHIR99021 (CH)).
3. Pozwól, aby napromieniowane γ MEF-y osiadły i przyczepiły się do powierzchni płytki przed hodowlą komórek E14.
4. Rozmrozić ESC E14 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i szybko przenieść komórki do stożkowej rurki o średnicy 15 cm z ciepłym podłożem mESC. Osadzać komórki w masie 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
5. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki mESC i ułożyć komórki na płytce hodowlanej zawierającej wcześniej napromieniowane γ MEF-y. Inkubować kulturę komórkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO₂ .
6. W celu pasażowania hodowli odessać pożywkę i umyć płytkę sterylną solą fizjologiczną 1x buforowaną fosforanem (PBS). Dodać tyle 0,05% trypsyny, aby pokryć powierzchnię płytki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
7. Zneutralizuj trypsynę za pomocą pożywki mESC i pipety, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową. Odwirować komórki o stężeniu 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
8. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek i zasiej około 5,0 x 10⁵ komórek na 10 cm płytce hodowlanej.
9. Zawiesić komórki w 10 ml pożywki mESC, umieścić komórki na pokrytej żelatyną płytce do hodowli tkankowej i inkubować kultury zgodnie z wcześniejszym opisem.
   nuta: Zaleca się pasażowanie mESC co 2 dni, aby zapobiec różnicowaniu się komórek w ich koloniach. Czerwień fenolowa w pożywce działa wyłącznie jako wskaźnik pH i w zależności od gęstości komórkowej może zmienić kolor na żółtawy (bardziej kwaśny) wcześniej niż 2 dni. W związku z tym może być konieczna codzienna zmiana podłoża. Napromieniowane γ MEF-y w końcu wymrą po kilku przejściach.

2. Różnicowanie EB, NPC i neuronów

1. Wykonaj protokół pasażowania kultury i policz komórki.
2. Metoda wiszącego upuszczania (dzień 0)
   1. W przypadku 10-centymetrowej płytki do hodowli komórkowej policz około 2,5 x 10⁴ komórki, z których 5,0 x 10² komórki zostaną zawieszone w pożywce różnicującej o objętości 20 μl (DMEM z 15% FBS, aminokwasami endogennymi, β-merkaptoetanolem, L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną i pirogronianem sodu). Około pięćdziesięciu kropelek o objętości 20 μl zawierających komórki można posiać na jednej płytce o średnicy 10 cm.
   2. Podzielić odpowiednią liczbę komórek, a następnie odwirować komórki przy 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
   3. Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki różnicującej dla gęstości komórek 5,0 x 10² komórek na 20 μl (np. 2,5 x 10⁴ komórki w 1 ml pożywki różnicowej).
   4. Za pomocą mikropipety lub pipety powtarzalnej umieścić 20 μl kropelek zawiesiny komórek na wieczku płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropelki nie znajdują się zbyt blisko siebie, aby zapobiec ich łączeniu się.
      nuta: Kropelki można umieszczać na płytce mocującej poddanej kulturze tkankowej lub płycie do zawieszania, ponieważ zostaną one umieszczone na pokrywie, a nie na samej płytce. Aby uzyskać bardziej wykonalne i sterylne podejście, umieść kropelki na płytki do hodowli tkankowej i przenieś je na płytkę do zawieszania, jak opisano poniżej.
   5. Napełnij talerz 5-10 ml 1x PBS i ostrożnie załóż pokrywkę z powrotem na talerz. Inkubować kulturę w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
      nuta: PBS dodaje się do płytki hodowlanej, aby zapobiec wysychaniu kropel.
3. W drugim dniu za pomocą mikropipety zebrać kropelki z pokrywki i umieścić je na 10-centymetrowej płytce zawiesinowej do hodowli komórkowych wypełnionej 10 ml pożywki różnicującej. Inkubować kulturę na wytrząsarce orbitalnej, wytrząsając się z małą prędkością w inkubatorze.
4. W 4 dniu, aby zebrać EBs, zebrać komórki, odwirować przy 200 x g przez 3 minuty i usunąć supernatant.
   nuta: EB można również myć 1x PBS zgodnie z wymaganiami kolejnych eksperymentów.
5. Aby kontynuować procedurę i indukować różnicowanie EB w nerwowe komórki progenitorowe (NPC), należy przygotować pożywkę różnicującą z 5 μM kwasem retinowym (RZS).
6. Usuń starą pożywkę, granulując EB w ilości 100 x g przez 3 minuty lub pozwól EB osiąść przed zasysaniem starej pożywki. Dodać 10 ml pożywki różnicującej zawierającej 5 μM RA do płytki hodowlanej.
7. W dniu 6 należy zastąpić co najmniej połowę pożywki świeżą pożywką zawierającą 5 μM RZS, przechylając płytkę i odpipetując pożywkę w sposób opisany powyżej.
   nuta: Zaleca się, aby co najmniej połowę pożywki zastąpić świeżą pożywką zawierającą RZS w dniach 5 i 7. Zwróć uwagę na wskaźnik czerwieni fenolowej; Jeśli zmieni kolor na żółtawy, najlepiej wymienić całe podłoże.
8. W dniu 8 zbierz NPC, zbierając komórki, odwirowując przy 200 x g przez 3 minuty i usuwając supernatant.
   nuta: NPC można również myć za pomocą 1x PBS w zależności od potrzeb kolejnych eksperymentów. W razie potrzeby NPC można zamrozić i ponownie rozmrozić w celu późniejszej hodowli i analizy. Jeśli NPC mają być hodowane, akutaza może być również stosowana jako alternatywa dla trypsyny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna + 0,53 mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0,1% Żelatyna	Sigma	G1890-100G	Przygotowany w wodzie dejonizowanej
CHIR99021	Chemikalia na Kajmanach	Numer katalogowy: 13122
DMEM (DMEM)	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 średni	Thermo Fisher Naukowy	11320033
Bufor EB	Qiagen powiedział:	Rok 19086
etanol	111000200	Pharmco	Rozcieńczony w wodzie dejonizowanej
Surowica bydlęca płodu	Atlanta Biologicals	Zobacz materiał S10250
L-glutamina	Thermo Fisher Naukowy	25030024
Lif	N/a	N/a	Pobrane z supernatantu MEF
MEM Aminokwasy endogenne	Corning	25-025-CL
PD0325901	Chemikalia na Kajmanach	Numer katalogowy: 13034
Penicylina/streptomycyna	Corning	30-002-CL
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	N/a	N/a	Przygotowany w wodzie dejonizowanej
Chlorek potasu	Zobacz materiał P217-500G	Firma VWR
Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny	0781-500G	Firma VWR
chlorek sodu	Zobacz materiał BP358-10	Odczynniki Fisher
Sód fosforan dwuzasadowy, siedmiowodny	Zobacz materiał SX0715-1	Milipore powiedział:
Kwas retinowy	Sigma	Czynnik R2625	Przygotowane w DMSO
Pirogronian sodu	Corning	25-000-CL
β-merkaptoetanol	Odczynniki biologiczne Fisher	Zobacz materiał BP176-100