$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Indukcja nerwowych komórek macierzystych
UWAGA: W zależności od warunków komórkowych, około 5 lub 7 dni po transfekcji, jednowarstwowe komórki przylegające osiągną 30 - 50% konfluencji (Rysunek 1C).
- Usunąć supernatanty zawierające pływające komórki i kulki, a następnie dodać 1 ml neuronalnej pożywki progenitorowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12), zawierającej 1x suplement N2, 0,1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% (v/v) antybiotyków, 20 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 20 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF)) do przylegających komórek.
- Opcjonalnie należy rozdzielić kulki komórkowe poprzez delikatne pipetowanie i odwirowywanie komórek przy sile 170 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki progenitorowej układu nerwowego na nowej 24-dołkowej płytce pokrytej matrycą zgodnie z instrukcją jako kopię zapasową.
- Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 60 - 80% zlewania się, zwykle po 1 tygodniu.
- Odrzucić supernatant i dodać 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych (pożywka bez surowicy, NSC SFM). Oddzielić komórki za pomocą skrobaka do komórek, a następnie bardzo delikatnie pipetować.
- Usuń komórki i wysiew je wszystkie w jednym dołku na 6-dołkowej płytce. Dodaj kolejny 1 ml pożywki z nerwowych komórek macierzystych, aby uzyskać 2 ml pożywki dla każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
- Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
- Gdy komórki osiągną 60% konfluencji, zdysocjuj i ponownie plateruj komórki w stosunku 1:3, wykonując kroki w 1.4 i 1.6.
