Wyciszanie genów za pośrednictwem siRNA w nerwowych komórkach macierzystych

Streszczenie

Źródło: Nguyen, B. H., et al. Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Ten film demonstruje użycie małego interferującego RNA (siRNA) do wyciszania określonych genów w nerwowych komórkach macierzystych i różnicowania ich w pożądane typy komórek za pomocą odpowiedniego podłoża różnicującego. Procedura ta umożliwia zbadanie kluczowej roli określonych genów w procesie różnicowania nerwowych komórek macierzystych.

Protokół

1. Manipulowanie komórkami O9-1

1. Przeprowadzanie knockdownu siRNA w komórkach O9-1
   1. Przed rozpoczęciem eksperymentu rozmrozić i pokryć 24-dołkową płytkę matrycą błony podstawnej. Odzyskaj i zasiew komórki O9-1, pozwalając im rosnąć do 60% do 80% konfluencji.
   2. Rozcieńczyć liposomy w pożywce bez surowicy zgodnie z odpowiednią objętością studzienki. Rozcieńczyć siRNA w pożywce bez surowicy do końca. Dodaj rozcieńczone siRNA do rozcieńczonych liposomów w proporcji zalecanej przez producenta. Dobrze wymieszać pipetując, a następnie inkubować.
      nuta: Postępuj zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą użytej objętości, czasu i temperatury inkubacji.
   3. Dodać odpowiednią objętość kompleksu siRNA-lipid do komórek zgodnie z zaleceniami producenta.
   4. Inkubować komórki przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ). W razie potrzeby wykonaj dalsze etapy (ekstrakcja RNA, ekstrakcja białek, barwienie itp.)
      UWAGA: czasy i stężenia siRNA mogą się różnić w zależności od indywidualnego eksperymentu.

2. Różnicowanie komórek O9-1

1. Różnicowanie komórek O9-1 w osteoblasty
   1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania kości, rozcieńczyć w alfa-MEM następujące roztwory (wskazane są końcowe stężenia): 0,1 μM deksametazonu, 100 ng/ml białka morfogenetycznego kości 2 (BMP2), 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 mM b-glicerofosforanu, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
   2. Wykryć marker osteoblastu, osteokalcynę, w zróżnicowanych osteoblastach za pomocą barwienia immunologicznego, jak pokazano na rysunku 1.
      UWAGA: Różnicowanie osteogenne można również ocenić za pomocą innych markerów osteoblastów lub barwienia czerwienią alizarynową lub barwienia fosfatazą alkaliczną.
2. Różnicowanie komórek O9-1 w komórki mięśni gładkich
   1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania komórek mięśni gładkich, rozcieńczyć w DMEM następujące roztwory (wskazane są końcowe stężenia): 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% FBS.
   2. Ocenia różnicowanie komórek mięśni gładkich za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom komórek mięśni gładkich, takim jak aktyna mięśni gładkich (SMA), pokazana jako przykład na rycinie 2.

Wyniki

Rycina 1: Barwienie immunofluorescencyjne markera osteoblastów osteokalcyny (Ocn) wskazujące, że komórki O9-1 dały początek komórkom osteoblastów w warunkach różnicowania osteogennego. Komórki barwiono markerem osteoblastów przeciwciałem Ocn (kolor zielony), a jądra barwiono DAPI (kolor niebieski). Strzałki wskazują komórki Ocn-dodatnie. Osteokalcyna (Ocn, marker osteoblastów); DAPI...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linia komórkowa grzebienia nerwowego czaszki myszy O9-1	Millipore Sigma	Zobacz materiał SCC049
DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11960-044
DMEM, wysoki poziom glukozy	Klon	SH30243.01
FBS (płodowa surowica bydlęca)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicylina - streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
L-glutamina 200mM (100X)	Gibco (firma Gibco)	25030-081
Trypsyna-EDTA 0,25% w HBSS	Genesee Scientific	25-510
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) bez wapnia i magnezu	Lonza	17-512F
MEM aminokwasy endogenne (MEM NEAA) 100X	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11140-050
Pirogronian sodu (100mM)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11360-070
2-merkaptoetanol	Sigma	Zobacz materiał M-7522
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy (rhFGF-zasadowy)	Systemy badawczo-rozwojowe	233-FB-025
Mitomicyna C	Roche	10107409001
Macierz macierzy	Corning	356234
DMSO (dimetylosulfotlenek)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofektamina RNAiMAX	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. 13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco (firma Gibco)	Nr katalogowy: 31985-070
Minimalna niezbędna pożywka, alfa 1X z solami Earle'a, rybonukleozydami, dezoksyrybonukleozydami i L-glutaminą	Corning	10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA	Dharmacon powiedział:	L-041057
Pula ON-TARGETplus niezwiązana z kierowaniem	Dharmacon powiedział:	D-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNA	Dharmacon powiedział:	L-046247
FCS (płodowa surowica cielęca)
ITS (insulina-transferyna-selen )
TGF-b3
kwas askorbinowy
BMP2 (białko morfogenetyczne kości 2)
deksametazon
Suplement B-27

TGL powiedział: powiedział: