Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja kolonii przypuszczalnie indukowanych komórek progenitorowych (iNPC)
- Na dzień przed pobraniem kolonii iNPC pokryj jedną 48-dołkową płytkę lamininą: rozcieńczyć lamininę do 1 μg/ml w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco, dodać 300 μl roztworu na płytki i utrzymywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Dzień później odessać lamininę z płytek i dodać 200 μl pożywki do neuroindukcji (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml ludzkiego czynnika hamującego białaczkę, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) do studzienek.
- Umyj 6 dołków zawierających kolonie, które mają być pobrane, raz za pomocą DPBS i dodaj 2 ml pożywki do neuroindukcji na dołek z 6-dołkową płytką. Zbieraj kolonie mechanicznie: zeskrob je wokół kolonii za pomocą cienkiej igły, aby pozbyć się otaczających komórek; Ustaw pipetarkę o pojemności 200 μl na 50 μl i pobierz kolonie za pomocą odpowiednich końcówek pipet.
- Przenieś po jednej kolonii do jednego dołka na 48-dołkowej płytce pokrytej lamininą i mechanicznie wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki, pipetując w górę iw dół 10 razy. Dodać inhibitor ROCK Y27632 w końcowym stężeniu 10 μM do komórek.
- Hodować komórki na 48-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 dni. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80 - 90% zbiegu (ok. 3 - 4 dni).
