$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Płytki 24-dołkowe Przygotowanie do hodowli neuronów o dużej gęstości
UWAGA: Wykonaj następujące kroki (2-3) dzień przed planowanym pobraniem zarodków.
- Umieścić dwie płytki 24-dołkowe w kapturze do hodowli komórkowej i otworzyć opakowanie indywidualne.
- Połączyć igłę ze strzykawką 18 G z plastikową strzykawką jednorazowego użytku o pojemności 1 ml.
- Trzymać strzykawkę i skierować końcówkę igły na ~1 mm w lewo do środka dna studzienki. Zastosuj umiarkowaną siłę (~250 g), aby wytrawić dno studzienki (o długości ~1 mm). Utworzy się rowek, a przemieszczone tworzywa sztuczne utworzą podwyższone podparcie nad powierzchnią studni o płaskim dnie. W podobny sposób wytrawić kolejny równoległy rowek o długości ~1 mm na prawo od środka dna.
- Powtórz ten krok dla wszystkich dołków dwóch 24-dołkowych płytek. Dwie 24-dołkowe płytki używane do hodowli o dużej gęstości są teraz gotowe do pokrycia poli-D-lizyną (patrz krok 2.8 poniżej).
2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do hodowli neuronów o niskiej gęstości
- Użyj okrągłego szkła o średnicy 12 mm #1.
- Umieść 50 szkiełek nakrywkowych w sterylnej plastikowej szalce Petriego o średnicy 100 mm i zanurz szkiełka nakrywkowe w 20 ml 70% roztworu etanolu. Umieść tę szalkę Petriego na obrotowej platformie z umiarkowaną (70 obr./min) prędkością obrotową na godzinę. Usuń 70% etanolu, a następnie zastąp świeżą partią 70% etanolu. Obróć i pierz przez kolejną godzinę.
- Wyrzuć 70% etanolowy roztwór czyszczący. Dodaj sterylną wodę (przefiltrowaną przez jednostkę filtrującą 0,2 μm). Dokładnie opłucz szkiełka nakrywkowe, obracając ręcznie szalkę Petriego. Spłucz trzy razy, za każdym razem zastępując świeżą sterylną wodą.
- Umieść szalkę Petriego ze szkiełkami nakrywkowymi w sterylnym kapturze do hodowli komórkowych z przepływem laminarnym. Zassać wodę do płukania przez przewód próżniowy i dodać 10 ml przefiltrowanej sterylnej wody, aby zanurzyć szkiełka nakrywkowe. Szkiełka nakrywkowe powinny być sterylne, a powierzchnia powinna być wystarczająco czysta, aby można było ją pokryć poli-D-lizyną.
- Otwórz dwie 24-dołkowe płytki z ich indywidualnego opakowania i umieść je w kapturze.
- Włącz przewód podciśnieniowy w okapie. Podłącz końcówkę do pipety o pojemności 200 μl do przewodu podciśnieniowego i użyj nożyczek, aby przeciąć końcówkę, aby utworzyć większy otwór.
- Użyj pęsety #5 z cienką końcówką, aby zebrać szkiełka nakrywkowe z szalki Petriego, pojedynczo, i użyj linii próżniowej, aby całkowicie wysuszyć szkiełko nakrywkowe. Następnie umieść po jednym szkiełku nakrywkowym w każdym z dołków 24-dołkowej płytki. 50 oczyszczonych szkiełek nakrywkowych powinno wystarczyć do wypełnienia każdej z dołków dwóch płytek 24-dołkowych.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy poli-D-lizyny (1 mg/ml) w roztworze roboczym (0,1 mg/ml) z buforem boranowym (pH 8,5). Dla czterech płytek 24-dołkowych (w tym dwóch płytek o dużej gęstości z wytrawionym dnem) należy przygotować 30 ml całkowitego roztworu roboczego.
- Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdej studzienki ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie zanurzone w roztworze. Jeśli nie, użyj końcówki pęsety #5, aby docisnąć szkiełka nakrywkowe do dna studzienki i użyj końcówki do prowadzenia roztworu poli-D-lizyny, aby pokryć całą powierzchnię szkiełek nakrywkowych. Sprawdź wzrokowo wszystkie szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że między płytką a szkiełkami nakrywkowymi nie zostało uwięzione powietrze.
- Dodać 300 μl 0,1 mg/ml roztworu roboczego poli-D-lizyny do każdego dołka płytki hodowlanej o dużej gęstości z wytrawionym dnem. Obróć ręcznie, aby rozprowadzić roztwór, aby pokryć całe dno studzienki.
- Umieścić wszystkie cztery płytki z poli-D-lizyną z powrotem w inkubatorze hodowli i inkubować O/N.
3. Mycie i wstępne przygotowanie talerzy do hodowli
UWAGA: Następujące kroki (3-5) są wykonywane w dniu pobrania tkanek.
- Po inkubacji/pokryciu szkiełkami nakrywkowymi i 24-dołkowymi płytkami O/N, wprowadzić wszystkie cztery płytki (dwie z szkiełkami nakrywkowymi dawcy, dwie akceptorowe płytki o wysokiej gęstości z wytrawionym plastikowym dnem) do kaptura hodowlanego. Użyj przewodu próżniowego, aby usunąć roztwór poli-D-lizyny.
- Natychmiast po usunięciu roztworu poli-D-lizyny dodać ~1 ml sterylnej wody do każdej studzienki za pomocą plastikowej pipety transferowej. Po napełnieniu wszystkich studni wodą odstaw na 10 minut. Usunąć wodę za pomocą próżni, a następnie dodać 300 μl pożywki myjącej do każdej studzienki, aby przykryć dno studzienki (ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi lub bez). Nie dopuścić do wyschnięcia powłoki poli-D-lizyny.
- Umieścić wszystkie cztery płytki z powrotem w inkubatorze komórkowym. Płytki są gotowe do użycia po przygotowaniu rozproszonych neuronów hipokampa.
4. Poszycie neuronów i długotrwała współkultura
- Umieść dwie 24-dołkowe płytki z wytrawionym dnem dla neuronów o dużej gęstości do kaptura hodowli komórkowej. Usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o dużej gęstości przy 250 000 neuronów/ml.
- Wprowadzić pozostałe dwie 24-dołkowe płytki ze szkiełkami nakrywkowymi do okapu hodowlanego i usunąć 300 μl pożywki kondycjonującej za pomocą próżni. Płytka 0,6 ml zawiesiny komórek o niskiej gęstości w stężeniu 10 000 neuronów/ml na szkiełkach nakrywkowych wewnątrz dwóch 24-dołkowych płytek.
- Umieścić wszystkie cztery płytki 24-dołkowe z powrotem w inkubatorze. Odstawić na 2 godziny.
- Odwróć szkiełka nakrywkowe o niskiej gęstości z przylegającymi neuronami do kultury o dużej gęstości. Upewnij się, że neurony są zwrócone do siebie (tj. nie są oddzielone szklanym szkiełkiem nakrywkowym). Następnie zwróć dwie płytki z kokulturą do inkubatora.
5. Podtrzymywanie kultury
- Podawać kokultury paszowe, dodając 300 μl świeżej pożywki paszowej (patrz Materiały) w ciągu dnia in vitro (DIV) 5. Nie ma potrzeby usuwania 50% oryginalnej, kompletnej pożywki hodowlanej, jak wynika z wielu innych badań. Pożywka zawiera również 15 μM arabinozydu cytozyny (Ara-C, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM), aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia i namnażania się gleju.
- Po tym wstępnym karmieniu co tydzień dodawaj do studzienki 300 μl świeżej pożywki bez Ara-C. Jeśli kultura jest przechowywana dłużej niż jeden miesiąc, należy zastąpić połowę pożywki świeżą pożywką co tydzień po upływie jednego miesiąca (z pierwszą połową wymianą pożywki przy DIV33). Morfologicznie zarówno neurony o wysokiej, jak i niskiej gęstości wyglądają zdrowo do trzech miesięcy (najdłuższy czas zaobserwowany przez eksperymentatorów).