Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Streszczenie

Źródło: Mao, X., et al. Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Protokół

1. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy

1. Przygotuj 0,1% pokryte żelatyną naczynia lub płytki do hodowli komórkowych.
   1. Dodaj 2 ml wysterylizowanej 0,1% żelatyny (0,1% w/v w wodzie) do naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm. Delikatnie kołysz, aby zapewnić równomierne pokrycie szalek z kultur komórkowych.
   2. Umieścić naczynia w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C i pozostawić do powlekania przez 1 godzinę.
   3. Usuń 0,1% roztwór żelatyny przed wysiewem komórek.
      nuta: Po wyjęciu żelatyny nie ma potrzeby suszenia ani mycia panierowanych naczyń.
2. Hodowla embrionalnych komórek macierzystych myszy (A2lox i 129)
   1. Inkubować komórki mESC (A2lox i 129) na pokrytych 0,1% żelatyną 60-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych w pożywce wzrostowej mESC w temperaturze 37 °C odpowiednio w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .} Pożywka wzrostu mESC składa się w 85% ze zmodyfikowanej mieszaniny pożywki Eagle i składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco, 15% zamiennika surowicy nokautującej (KSR), 0,1 mM β-merkaptoetanolu (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% aminokwasu endogennego (NEAA), 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), czynnika hamującego białaczkę 1000 U/ml (LIF), 10 nM CHIR-99021 (inhibitor GSK-3) i 0,33 nM PD0325901 (inhibitor MEK).
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest łatwopalny i ma toksyczność inhalacyjną. Trzymaj z dala od źródeł ognia i noś maskę, aby uniknąć wdychania podczas użytkowania.
   2. Codziennie zmieniaj pożywkę wzrostową mESC, aby uzyskać lepszy wzrost A2lox i 129.
   3. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, usuń pożywkę i dodaj 1 ml 0,1% trypsyny do naczynia. Delikatnie kołysz przez 30 sekund, aby zapewnić równomierne pokrycie trypsyny na wszystkich komórkach.
   4. Pozostaw komórki na około 1 minutę do trypsynizacji, a następnie usuń trypsynę za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
   5. Dodać 2 ml pożywki wzrostowej mESC do naczynia, kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
   6. Policz gęstość komórek w zawiesinie tak dokładnie, jak to możliwe, za pomocą hemocytometru.
   7. Podziel komórki na 7 grup i wywołaj różnicowanie za pomocą różnych protokołów pokazanych w Tabeli 1.

2. Różnicowanie między mESC a NPC

1. Przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki do hodowli komórkowych lub szkiełka nakrywkowe.
   1. Przed użyciem należy przygotować 0,1% pokryte żelatyną płytki 6-dołkowe lub szkiełka nakrywkowe, jak w kroku 1.1.
2. Zróżnicowanie (tabela 1)
   1. Dodać 1,5 x 10⁶ mESC do nieprzywierającego naczynia bakteryjnego w 10 ml podstawowej pożywki różnicującej I, aby umożliwić tworzenie ciał zarodka w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ .
   2. Po 2 dniach przenieś agregaty komórek do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i pozwól im osiąść grawitacyjnie.
   3. Usunąć supernatant i dodać 10 ml świeżej pożywki do różnicowania podstawowego I w celu ponownego zawieszenia ciał zarodków. Przesadź je ponownie do nowego, nieprzywierającego naczynia bakteryjnego i pozwól im się różnicować przez kolejne 2 dni.
   4. Sprawdź formowanie się ciał zarodkowych pod mikroskopem (ryc. 1A).
   5. Pobrać ciała zarodków zgodnie z opisem w krokach 2.2.2-2.2.3. Wysiewać około 50 ciał zarodkowych w 2 ml podstawowej pożywki różnicującej I na studzienkę na 0,1% 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną.
   6. Przygotować 1 mM wywaru z kwasu all-trans retinowego (RA) (w DMSO) i przechowywać z dala od światła w zamrażarce o temperaturze -80 °C po zapakowaniu.
      nuta: RZS jest niestabilny i należy zwrócić uwagę na trzymanie go z dala od światła i zmniejszenie kontaktu powietrza podczas przygotowywania wywaru RA.
   7. W przypadku indukcji RA dodać 2 μl wywaru RA do każdej studzienki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM.
   8. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C i różnicować przez kolejne 4 dni.
   9. Zmieniaj całe 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I (z 1 μM RA) co 2 dni.

Tabela 1: Szczegóły protokołu użytego do różnicowania.

protokół	media
4-dniowe tworzenie ciał zarodkowych + 4-dniowa indukcja RZS	Podstawowe różnicowanie średnie: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0,1mM 2ME+ 1%P/S

Wyniki

Rycina 1: Morfologia ciał zarodków. (A) Ciała zarodków hodowane przez 4 dni. (B) Ciała zarodków hodowane przez 2 dni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement B-27 (50X), bez surowicy	Gibco (firma Gibco)	17504044	przechowywany w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck powiedział	Zobacz materiał S1263	przechowywane w temperaturze -20 °C
Szkiełka nakrywkowe	gniazdo	801007
Surowica bydlęca płodu	Klon HyClone	SH30084.03	przechowywać w temperaturze -20 °C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
żelatyna	Gibco (firma Gibco)	CM0635B	przechowywany w temperaturze pokojowej
Suplement GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	przechowywany w temperaturze 4 °C
Nokaut DMEM/F-12	Gibco (firma Gibco)	12660012	przechowywany w temperaturze 4 °C
Wymiana serum KnockOut	Gibco (firma Gibco)	10828028	przechowywać w temperaturze -20 °C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
MEM Roztwór aminokwasów endogennych	Gibco (firma Gibco)	11140076	przechowywany w temperaturze 4 °C
Suplement N-2 (100X)	Gibco (firma Gibco)	17502048	przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco (firma Gibco)	21103049	przechowywany w temperaturze 4 °C
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)	Klon HyClone	SH30256.01 mld	przechowywany w temperaturze 4 °C
Roztwór penicyliny/streptomycyny	Klon HyClone	SV30010	przechowywany w temperaturze 4 °C
PD0325901(mirdametynib)	Selleck powiedział	Zobacz materiał S1036	przechowywane w temperaturze -20 °C
Kwas retinowy	Sigma	Czynnik R2625	przechowywać w temperaturze -80 °C i chronić przed światłem
Szczep 129 embrionalnych komórek macierzystych myszy	Cyagen	MUAES-01001	Utrzymywany w systemie hodowli bez karmnika
Trypsyna 0,25% (1X) Roztwór	Klon HyClone	SH30042.01	przechowywany w temperaturze 4 °C
2-merkaptoetanol	Gibco (firma Gibco)	21985023	przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem
Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm	Corning	430166
Probówka wirówkowa o pojemności 15 ml	Nunc	Numer telefonu 339650