Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych w neurony

Streszczenie

Źródło: Mao, X., et al. Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Film prezentował metodę hodowli komórkowej do różnicowania neuronalnych komórek progenitorowych w neurony. Poprzez inkubację komórek w pożywce bogatej w składniki odżywcze uzupełnionej czynnikami wzrostu, komórki progenitorowe dojrzewały do neuronów z rozwiniętymi aksonami i dendrytami. Środek stabilizujący zapewniał żywotność komórek i chronił przed uszkodzeniami oksydacyjnymi w całym procesie różnicowania.

Protokół

1. Różnicowanie od NPC do neuronów (Faza II)

1. Wysiewać około 5 x 10⁵ mysich embrionalnych komórek macierzystych lub pochodnych mESC w ciągu 2 ml podłoża do różnicowania podstawowego I na basenie na 6-dołkowe płytki pokryte żelatyną, pokryte 0,1%. Losowo podziel pochodne mESC na 3 grupy, odpowiednio jako protokół 1 fazy II, protokół 2 i protokół 3.
2. Umieścić płytkę w inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C, aby umożliwić naczepianie na 6 godzin. Przemyć je dwukrotnie 2 ml PBS.
3. Dodać 2 ml pożywki do różnicowania podstawowego I, pożywki N2B27 I i pożywki N2B27 II (Tabela 1) odpowiednio do każdej studzienki z powyższych grup.
4. Umieść płytki w inkubatorze i pozwól im się rozróżnić przez kolejne 10 dni. Zmieniaj odpowiednie podłoże co 2 dni.
5. Sprawdź stan różnicowania i zapisz zmiany morfologiczne, jak wspomniano w kroku 3.
6. W dniu 18 oceń generowanie neuronów (dodatnie β-tubuliny III) i określ skuteczność różnicowania 3 protokołów użytych w kroku 4.

Wyniki

Tabela 1: Szczegóły 3 protokołów stosowanych w fazie II różnicowania.

Faza różnicowania II (10d)
	Protokołów	media
Protokół 1	Naturalne różnicowanie: Z podłożem różnicującym podstawowym tylko I	Podstawowe podłoże różnicujące I...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało anty-β-tubuliny III wytwarzane u królika	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T2200	przechowywać w temperaturze -80 °C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Suplement B-27 (50X), bez surowicy	Gibco (firma Gibco)	17504044	przechowywany w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem
DME/F-12 1:1 (1x)	Klon HyClone	SH30023.01 mld	przechowywany w temperaturze 4 °C
Surowica bydlęca płodu	Klon HyClone	SH30084.03	przechowywać w temperaturze -20 °C, unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania
Mikroskopia fluorescencyjna	Olympus	CKX53
żelatyna	Gibco (firma Gibco)	CM0635B	przechowywany w temperaturze pokojowej
Suplement GlutaMAX	Gibco (firma Gibco)	35050061	przechowywany w temperaturze 4 °C
Barwienie immunologiczne Bufor do rozcieńczania przeciwciał pierwotnych	Beyotime	Zobacz materiał P0103	przechowywany w temperaturze 4 °C
Nokaut DMEM/F-12	Gibco (firma Gibco)	12660012	przechowywany w temperaturze 4 °C
MEM Roztwór aminokwasów endogennych	Gibco (firma Gibco)	11140076	przechowywany w temperaturze 4 °C
Suplement N-2 (100X)	Gibco (firma Gibco)	17502048	przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem
Normalna surowica kozia	Jackson	005-000-121	przechowywane w temperaturze -20 °C
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco (firma Gibco)	21103049	przechowywany w temperaturze 4 °C
Nieprzywiejne naczynie bakteryjne	Corning	3262
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)	Klon HyClone	SH30256.01 mld	przechowywany w temperaturze 4 °C
Roztwór penicyliny/streptomycyny	Klon HyClone	SV30010	przechowywany w temperaturze 4 °C
PD0325901(mirdametynib)	Selleck powiedział	Zobacz materiał S1036	przechowywane w temperaturze -20 °C
Kwas retinowy	Sigma	Czynnik R2625	przechowywać w temperaturze -80 °C i chronić przed światłem
Szczep 129 embrionalnych komórek macierzystych myszy	Cyagen	MUAES-01001	Utrzymywany w systemie hodowli bez karmnika
2-merkaptoetanol	Gibco (firma Gibco)	21985023	przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić przed światłem
4% paraformaldehydu	Beyotime	Zobacz materiał P0098	przechowywane w temperaturze -20 °C
6 - płytka dołkowa	Corning	Numer katalogowy: 3516
Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm	Corning	430166
Probówka wirówkowa o pojemności 15 ml	Nunc	Numer telefonu 339650

powiedział: TGL : powiedział: