Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Dysocjacja zwojów sensorycznych
- Odpipetować 500 μl roztworu dysocjacji zwojów nerwowych (GaDS) (Tabela 1), pozostawiając zwoje w probówce. Przemyć zwoje jaj raz, dodając 1 ml roztworu buforu fosforanowego (PBS), poczekać, aż zwoje osiądą na dnie probówki, a następnie odpipetować PBS.
- Do każdej probówki dodać 1 ml GaDS i 22 μl enzymu trawiącego (kolagenaza I/II i mieszanina proteaz, 2,5 mg/ml w wodzie).
- Dodać 20 μl Fast Blue (5,26 mM) do probówki kontroli dodatniej.
- Umieść rurki w łaźni wodnej lub bloku grzewczym ustawionym na 37 °C.
- Co 15 minut potrząsaj krótko probówkami i przesuwaj je, aby upewnić się, że zwoje są pokryte roztworem.
nuta: Czas trawienia zwojów zależy od wieku enzymu trawiącego. W ciągu miesiąca od rozpuszczenia enzymu wytrawiającego trawić przez 30 minut; W ciągu 2 - 6 miesięcy trawić przez 45 min. Jeśli enzym ma ponad sześć miesięcy, trawić zwoje jaj przez 60 minut.
- Podczas trawienia zwojów jajowych należy przygotować gradienty gęstości za pomocą roztworu cząstek (koloidalne cząstki krzemionki pokryte poliwinylopirolidonem).
- Zmieszać 12% roztwór cząstek w GaDS, 500 μl na próbkę.
- Wymieszać 28% roztwór cząstek w GaDS, 500 μl na próbkę.
- Powoli i ostrożnie dodawać 400 μl roztworu o gęstości 12% na wierzch 400 μl roztworu o gęstości 28% w świeżej probówce o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki. Nie pozwól, aby dwie warstwy się zmieszały. W tubie powinny być widoczne dwie wyraźne warstwy, jedna ciemniejsza od drugiej.
- Po odpowiednim czasie trawienia usunąć GaDS enzymem wytrawiającym i dwukrotnie przemyć zwoje jaj 1 ml PBS. Do każdej probówki dodać 200 μl świeżego GaDS.
- Użyj pipety o pojemności 200 μl, ustaw objętość 100 μl i kilkakrotnie pipetuj zwoje w górę i w dół, aby rozdzielić komórki. Powtarzaj, aż nie będzie widać nienaruszonego kawałka tkanki. Unikaj tworzenia pęcherzyków w roztworze.
- Przepuść zdysocjowane komórki przez sitko o średnicy 70 μm.
- Dodaj kolejne 100 μl GaDS do oryginalnej probówki dysocjacyjnej, aby zebrać wszelkie pozostałe zabłąkane komórki i przepuścić dodatkowy roztwór przez sitko do komórek. Używając nowej końcówki pipety, zbierz pozostałą ciecz zawierającą komórki, która przeszła przez sitko i przylgnęła do siatki. Ostateczna objętość komórek zawieszonych w GaDS wynosi 300 μl.
- Ostrożnie ułóż 300 μl komórek na wcześniej utworzonym gradiencie gęstości. Unikaj pęcherzyków i mieszania komórek z warstwami gęstości.
- Wirować przez 10 minut przy 2 900 x g w temperaturze pokojowej.
- Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń i wyrzuć górną warstwę 700 μl. Warstwa ta zawiera większość resztek komórek, które w przeciwnym razie będą przeszkadzać w sortowaniu komórek.
- Dodać 700 μl świeżego GaDS do pozostałej komory zawierającej roztwór i kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać.
- 18. Wirować przez 15 minut przy 2,900 x g do komórek osadzających.
- 19. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant, pozostawiając osad komórkowy.
- Zawiesić osad komórkowy w 200 - 300 μl GaDS, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety 1 000 μl ustawionej kilkakrotnie na 200 μl. Umieść próbki na lodzie.
Tabela 1. Mieszanina odczynników do roztworu dysocjacji zwojów nerwowych (GaDS).
| składnik | kwota |
| Zaawansowany DMEM/f12 | Pojemność 9,5 ml |
| glutamina | 100 μl |
| FILTR ELEKTROMAGNETYCZNY (10 mM) | 100 μl |
| Suplement N2 | 100 μl |
| B27 (bez witaminy A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
