Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Poniższy protokół opisuje metodę przygotowania i hodowli do długotrwałej inkubacji i przerywanego obrazowania wycinków hipokampa. Pojedynczy wycinek hipokampa jest mocowany do specjalnie przygotowanego blaszki nakrywkowej za pomocą skrzepu plazmowego, a następnie szkiełka nakrywkowe są uszczelniane na płaskiej stronie wywierconej rurki rolkowej, która jest utrzymywana w inkubatorze rolkowym.
1. Przygotowanie stojaka na rury rolkowe
- Użyj szablonu pokazanego na rysunku 1A wydrukowanego do rozmiaru pokazanego na listwie podziałki. Za pomocą gwoździa wybij małe otwory (wystarczająco duże, aby można było umieścić drobny znacznik punktowy) w szablonie wyśrodkowanym na otworach.
- Umieść szablon na dnie naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 15 cm (średnica nominalna 14 cm) i zaznacz położenie otworów. Powtórz to na drugim daniu.
- Za pomocą wierteł przeznaczonych do użytku na plastiku wywierć sześć otworów o średnicy 1.5 cm na każdej czaszy w sześciokątnym układzie (4.8 cm od środka do środka) ze środkami otworów 2.5 cm od krawędzi naczynia. Wywierć trzy otwory (o średnicy 3 mm) w odległości 12 mm od krawędzi, które są umieszczone w równej odległości między dwoma większymi otworami, jak pokazano na rysunku 1A.
- Dnem każdej naczynia skierowanym do siebie umieść maszynową o długości 2.5 cala (średnica 3/16 cala) z płaską podkładką przez jeden z małych otworów, a następnie drugą płaską podkładkę, kawałek rurki polietylenowej (przekładka, 4.7 cm), kolejną płaską podkładkę, drugą naczynie do hodowli tkankowej, kolejną płaską podkładkę, podkładkę blokującą, i orzech.
- Powtórz krok 1.4 na pozostałych dwóch maszynowych i dokręcaj tylko luźno, aż wszystkie maszynowe znajdą się na swoim miejscu. Następnie mocno dokręć nakrętki.
- Wbij przelotki (grubość 5/16 cala, średnica otworu 5/8 cala) w otwory dolnej naczynia, aby uzyskać końcowy stojak na rurki rolkowe (Rysunek 1B; pokazany z dwiema rurkami na miejscu). Umieść naklejkę na każdym stojaku z unikalnym numerem.
2. Przygotowanie rur rolkowych i szkiełek nakrywkowych
- Wykonanie przyrządu do wiercenia otworu w rurach rolkowych
- Wywierć otwór o średnicy 1.5 cm o głębokości 8 cm w środkowej stronie drewnianego klocka o wymiarach 2 x 4 x 5,5 cala pod takim kątem, aby płaska strona rury rolkowej była prawie równoległa do klocka po włożeniu (Rysunek 2A).
- Powiększ otwór za pomocą okrągłego pilnika do drewna, aby zarówno poszerzyć, jak i zwęzić otwór, aby umożliwić wprowadzenie rurki (rurki rolkowe mają nieco większą średnicę w pobliżu końca nasadki) (Rysunek 2B).
- Wywierć pionowy otwór o średnicy 1.5 cm, 5.5 cm od boku bloku i wyśrodkowany nad bocznym otworem (Rysunek 2C).
- Gdy boczny otwór jest wystarczająco zwężany, włóż rurkę rolkową, która jest zaznaczona w żądanym miejscu, aby wyśrodkować otwór na plaster i ustawić rurkę tak, aby zaznaczone miejsce było wyśrodkowane w pionowym otworze o długości 1.5 cm.
- Wyjmij rurkę i zmierz odległość od miejsca do końca rurki. Zaznacz tę odległość od środka otworu w przyrządzie i włóż gwóźdź, aby zapewnić ogranicznik do prawidłowego ustawienia rurki do wiercenia (strzałka na rysunku 2C).
- Użyj piły do metalu, aby odciąć gwóźdź równo z powierzchnią drewnianego klocka, aby zapobiec obrażeniom.
- Dodaj zaciski sprężynowe na spodzie przyrządu, jeśli znajduje się wiertarka ze szczelinami, które umożliwiają jej zakotwiczenie (Rysunek 2D strzałka). W przeciwnym razie użyj C-clamps, aby bezpiecznie przytrzymać przyrząd do wiertarki.
- Używając opisanego powyżej przyrządu, aby przytrzymać i ustawić płaską plastikową rurkę hodowlaną o średnicy 11 cm płaską stroną do góry (Rysunek 2A), wywierć otwór o średnicy 6 mm ze środkiem 1.0 cm od dołu i wyśrodkowanym między bokami probówki.
nuta: Należy użyć wiertła przeznaczonego do plastiku.
- Za pomocą obrotowego narzędzia do gratowania wygładź krawędzie otworu (Rysunek 2E) i wykonaj 4 rowki na wewnętrznej krawędzi otworu (Rysunek 2E, wstawka), aby ułatwić opróżnianie otworu podczas obracania.
- Za pomocą dziurkacza o średnicy 12 mm wytnij krążki o średnicy 12 mm z nietoksycznych dwustronnych arkuszy kauczuku silikonowego z klejem. Za pomocą standardowego dziurkacza do papieru z jednym otworem (średnica 6 mm) wykonaj otwór w środku każdego dysku.
- Wypłucz wiercone rurki 70% etanolem, wysusz je na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego i sterylizuj probówki i dziurkowane krążki samoprzylepne przez 40 minut pod lampą ultrafioletową (UV) (30 W przy średniej odległości 70 cm) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Po - 20 minutach należy ponownie ustawić probówki i krążki, aby wszystkie odsłonięte powierzchnie zostały wysterylizowane. W sterylnych warunkach oderwij biały nośnik z krążka samoprzylepnego i przymocuj gumę silikonową na zewnątrz tuby, wyrównując otwory (Rysunek 2F).
ostrożność: Aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie UV, załóż okulary ochronne i zamknij obudowę przed włączeniem UV lamp.
- Czyste blaszki nakrywkowe o średnicy 12 mm (100 centralnie ponumerowanych kwadratów 1 mm) niemieckie szkiełka nakrywkowe. Delikatnie przytrzymaj szkiełka nakrywkowe kleszczami i zanurz je w absolutnym etanolu, następnie w wodzie, a następnie ponownie w absolutnym etanolu, a na koniec zanurz szkiełka nakrywkowe w płomieniu, aby spalić etanol. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do ostygnięcia.
- Trzymając szkiełka nakrywkowe kleszkami, zanurz w 2% 3-aminopropylotrietoksysilanie w acetonie na 10 s. Opłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
- Umieść szkiełka nakrywkowe na sterylnej bibule filtracyjnej wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego i włącz światło UV. Odsłaniaj szkiełka nakrywkowe z każdej strony przez 20 minut
ostrożność: Aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie UV, załóż okulary ochronne i zamknij obudowę przed włączeniem UV lamp.
3. Przygotowanie plastrów hipokampa
- Przed rozpoczęciem sekcji przygotuj połówki obosiecznych żyletek do rozdrabniacza tkanek. Ostrożnie złóż ostrza wzdłuż palcami i zatrzaśnij na pół.
- Opłucz połówki ostrzy acetonem za pomocą bawełnianego wacika, aby je wyczyścić, a następnie spłucz w absolutnym etanolu i wysusz na powietrzu. Przed zamontowaniem połówki ostrza na rozdrabniaczu tkanek wysterylizuj go, spłukując 70% etanolem.
- Postępuj zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania; po znieczuleniu izofluranem poddaj eutanazji 4-7-dniowe młode myszy lub szczura przez ścięcie głowy i usuń głowę nożyczkami lub gilotyną.
nuta: Protokół hodowli wycinków mózgu jest niezależny od szczepu lub genotypu myszy lub szczura. Wykorzystano wiele transgenicznych linii myszy o różnym pochodzeniu genetycznym.
- Opłucz głowę 70% etanolem i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Do momentu ostatecznego zamontowania wycinka mózgu na rurze rolkowej, wszystkie poniższe kroki są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność.
- Za pomocą ostrza chirurgicznego #21 wykonaj strzałkowe przecięcie skóry i czaszki. Za pomocą kleszczy Dumont #5 oderwij skórę i czaszkę, aby odsłonić mózg.
- Za pomocą zamkniętych kleszczy delikatnie wydłub cały mózg, uwalniając go, ściskając kleszczami przez pień mózgu za móżdżkiem. Umieść mózg w sterylnym naczyniu o średnicy 60 mm zawierającym 4 °C Zrównoważony roztwór soli Gey's / 0,5% glukozy (GBSS / glukoza).
- Używając mikroskopu preparacyjnego do wizualizacji mózgu (ryc. 3A), umieść mózg grzbietową stroną do góry i odetnij przednią trzecią część mózgu i móżdżek za pomocą ostrza chirurgicznego (ryc. 3B).
- Za pomocą kleszczy przytrzymaj przycięty mózg tylną stroną do góry i brzuszną stroną do boku szalki Petriego, aby zapewnić stabilność. Delikatnie odczep opony mózgowe wokół strzałkowej linii środkowej i usuń tkankę śródmózgowia za pomocą kleszczyków Dumont #5 z cienką końcówką (ryc. 3C, przerywane kółko).
- Wykonaj dwa nacięcia wzdłuż boku mózgu, aby go otworzyć (Ryc. 3C, linie przerywane). Gdy mózg zostanie umieszczony grzbietowo do dołu i rozłożony na zewnątrz, szczelina hipokampa powinna być widoczna (ryc. 3D, strzałka).
- Przenieś rozprowadzony otwarty mózg na kawałek folii z tworzywa sztucznego z polichlorotrifluoroetylenu i umieść go do krojenia na etapie rozdrabniania tkanek. Zwilż ostrze GBSS/glukozą i posiekaj hipokamp na plastry o grubości ~300 μm.
- Za pomocą pipety transferowej spłucz pokrojony mózg z folii z tworzywa sztucznego do świeżego naczynia o średnicy 60 mm zawierającego GBSS/glukozę (ryc. 3E). Delikatnie uszczypnij i odczep cienkimi szczypcami pozostałe opony mózgowe i inne tkanki niezwiązane z hipokampem (ryc. 3F) z plastrów (ryc. 3G, H).
4. Plastry poszycia
- Po uzyskaniu plastrów umieść 2 μl osocza kurzego na środku blaszki fototrawionej przygotowanego szkiełka nakrywkowego. Lekko rozprowadź plazmę, aby uzyskać plamkę o średnicy 3-4 mm.
nuta: Blaszona fototrawiona strona to górna strona szkiełka nakrywkowego, gdy patrzy się na nią przez mikroskop preparacyjny, tak aby liczby były prawidłowo zorientowane.
- Przenieś 1 wycinek mózgu za pomocą sterylnej szpatułki z wąską końcówką (Figura 4A) do plamki plazmy (Figura 4B). Użyj zamkniętych kleszczy, aby utrzymać plasterek na końcówce szpatułki, jednocześnie podnosząc plasterek z GBSS/glukozy.
- Przyłóż szpatułkę do plamki plazmy na szkiełku nakrywkowym i przy zamkniętych kleszkach dociśnij plasterek do szkiełka nakrywkowego.
- Wymieszać 2,5 μl osocza z 2,5 μl trombiny w osobnej probówce. Szybko umieść 2,5 μl tej mieszaniny nad i wokół plasterka i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby ją wymieszać (Rysunek 4B).
nuta: Osocze skrzepnie w ciągu 10-15 sekund, więc należy to zrobić szybko. Jeśli problemem jest przyleganie plastrów, zmieszaj 5 μl osocza z 5 μl trombiny i użyj 4-5 μl na plasterku, usuwając część po wymieszaniu, tak aby plasterek leżał płasko na szkiełku nakrywkowym.
- Usuń przezroczystą plastikową osłonę z odsłoniętej strony kleju z kauczuku silikonowego uprzednio przymocowanego do rurki rolkowej i umieść szkiełko nakrywkowe z plastrem mózgu na kleju, wyrównując plasterek w otworze (Rysunek 4C).
- Aby zapewnić przyczepność, należy delikatnie i równomiernie docisnąć szkiełko nakrywkowe kciukiem, równomiernie dociskając szkiełko nakrywkowe i przytrzymując je przez około 1 minutę podczas przenoszenia do szafy bezpieczeństwa biologicznego.
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 0,8 ml kompletnej pożywki hodowlanej Neurobaseal A (tabela materiałów) do każdej probówki (ryc. 4D).
- Przepuścić mieszaninę 5% CO2/95% powietrza przez sterylną pipetę Pasteura z bawełnianą zatyczką, bezpiecznie przytrzymywaną przez zacisk. Przepłukać rurkę rolkową mieszaniną gazów i szybko zakryć rurkę w miarę jej wyjmowania z okolic pipety.
- Oznacz probówki numerem plastra i numerem stojaka. Włóż rurki do stojaka na rolki, upewniając się, że są geometrycznie wyważone. Jeśli liczba rurek jest nieparzysta, dodaj rurki, aby zrównoważyć.
- Umieść stojaki w inkubatorze rolkowym o temperaturze 35 °C z rolkami obracającymi zębatkę rolkową z prędkością około 10-13 obrotów na godzinę (RPH) (Rysunek 4E). Aby utrzymać pożywkę na dnie probówek, przechyl inkubator do tyłu o około 5°, podnosząc jego przód na desce.
