1. Standaryzacja kultur neuronalnych za pomocą urządzeń mikroprzepływowych: Montaż urządzenia
- Wybierz odpowiednie urządzenie mikroprzepływowe do żądanego eksperymentu. Aby połączyć neurony w tej samej populacji, użyj urządzeń neurologicznych (ryc. 1), a aby połączyć neurony w różnych populacjach, użyj urządzeń do współhodowli (ryc. 2).
- Oczyść i przygotuj żądaną liczbę sterylnych szkiełek nakrywkowych lub naczyń ze szklanym dnem. Aby uzyskać najlepsze rezultaty na powierzchniach plastikowych, użyj naczyń o średnicy 35 mm, na szkle użyj szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm lub naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Wybierz grubość szkła w zależności od systemu obrazowania, na przykład 0,15 mm.
- Pokryj naczynia lub szkiełka nakrywkowe 0,5-1 ml 100 μg/ml PDL przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej.
nuta: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu i wznowiony następnego dnia, jeśli jest to pożądane. Co więcej, naczynia mogą być pokryte PDL rozcieńczonym buforem boranowym, poli-L-lizyną (PLL), lamininą lub dowolną inną cząsteczką adhezyjną komórek.
- Umyj naczynia dwukrotnie wodą (nie używaj soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ kryształki soli mogą zablokować kanały), usuń cały płyn i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym środowisku, takim jak szafka bezpieczeństwa biologicznego, przez 5-10 minut lub do całkowitego wyschnięcia powierzchni.
nuta: Należy uważać, aby szkiełka nakrywkowe były całkowicie suche, ponieważ pozostały płyn będzie zakłócał przyleganie układów mikroprzepływowych.
- Umieść urządzenia mikroprzepływowe z wzorami skierowanymi do góry pod wpływem światła UV w sterylnym środowisku (komora bezpieczeństwa biologicznego) na 10 minut. Pamiętaj, aby przestrzegać sterylnych procedur podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego10.
- Za pomocą pęsety umieść urządzenie mikroprzepływowe z wzorem skierowanym w dół w kontakcie z czystym szkiełkiem nakrywkowym/naczyniem. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij urządzenie, aby przylegało do szkła.
nuta: Przezroczystość przyleganego obszaru będzie widoczna, gdy patrzy się pod światło. Upewnij się, że wszystkie rogi stykają się ze szkłem. Zrób to ze wszystkimi urządzeniami mikroprzepływowymi. Zobacz rysunek 1a.
- Aby napełnić urządzenie jednopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 50 μl kompletnej pożywki komórkowej uzupełnionej bezsurowicą B-27 (stosunek objętości 1:50) i 500 μg/ml penicyliny/streptomycyny/glutaminy (zwanych łącznie NBM) do prawej górnej studzienki, a następnie dodaj kolejne 50 μl do studzienki leżącej po przekątnej. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych dwóch studzienek. Zobacz rysunek 3a.
- Aby napełnić urządzenie wielopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 30 μl pełnego NBM do odpowiednich studzienek, patrz rysunek 2a. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych czterech studzienek.
- Umieść urządzenia na większej płycie z otwartym naczyniem z autoklawowaną wodą (komora mokra) i umieść w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) na 1-2 godziny podczas przygotowywania hodowli komórkowej. Zobacz rysunek 3b.
2. Powlekanie neuronów w układach mikroprzepływowych
- Postępując zgodnie z protokołem, uzyskaj zdysocjowane neurony hipokampa lub kory mózgowej z zarodków szczurów Sprague Dawley (dowolnej płci).
- Ponownie zawiesić neurony embrionalne w NBM w stężeniu 1-2 milionów neuronów/ml. Sprawdź stężenia komórek w mikroskopie za pomocą hemocytometru i zgodnie z odniesieniem8. Dostosuj stężenie komórek zgodnie z żądaną gęstością komórek. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie pojedynczych aksonów hipokampa na kanał, umieść 10 000 neuronów na urządzenie. Aby mieć wiele aksonów w tym samym kanale, umieść 60 000 neuronów na urządzenie.
Uwaga: Liczby te różnią się w zależności od użytego typu neuronu.
- Usunąć pożywkę z urządzeń mikroprzepływowych bez opróżniania studzienek. Pozostaw około 5 μl w każdym.
- Aby umieścić komórki w urządzeniu z pojedynczą populacją, dodaj 50 μl NBM do prawego dolnego dołka. W tym momencie medium przepływa samoczynnie, aby wypełnić drugą dolną studzienkę. Dodać 20 μl roztworu koncentratu do prawego górnego dołka urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano na rysunku 1b.
- Do komórek płytki w urządzeniu do wielokrotnej populacji dodać 20 μl roztworu komórek skoncentrowanych do każdej z odpowiednich studzienek na rysunku 2a.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki znajdują się w komorach i umieść urządzenia w inkubatorze na 15-30 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek do podłoża.
- Sprawdź w mikroskopie, czy w komorach jest wystarczająca liczba komórek. Jeśli potrzeba więcej, powtórz kroki 2.4 i 2.5.
- Dodać 50 μl NBM do 2 górnych studzienek urządzenia z pojedynczą populacją i 20 μl NBM do tego samego dołka, w którym komórki zostały wstrzyknięte do urządzenia wielopopulacyjnego. Podłoże lekko wystaje, tworząc dodatni menisk, nadając studzienkom górny wygląd muffinki. Ponownie patrz rysunek 3a.
- Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
3. Utrzymanie kultur neuronalnych
- Usunąć NBM (około 30 μl za pomocą pipety) z komórek i nałożyć nowy, wstępnie podgrzany NBM następnego dnia po ich wprowadzeniu do urządzeń (tj. 1 d po kroku 2).
- Sprawdzaj co 2 dni, czy w każdym kanale jest wystarczająca ilość nośnika. Jeśli wierzch muffinek jest niski, po prostu dodaj więcej podłoża do górnych dołków.
- Hodować komórki przez co najmniej 7 dni przed usunięciem urządzeń mikroprzepływowych. Komórki mogą przetrwać w tych urządzeniach przez kilka tygodni. Wyjmij urządzenia 1-2 dni przed przeprowadzeniem eksperymentów na próbkach.
4. Usuwanie urządzeń mikroprzepływowych
- 1 - 2 dni przed wyjęciem urządzeń mikroprzepływowych, dodać 2 ml NBM wstępnie podgrzanego do 37 °C do każdej płytki na próbkę, zalewając komory, i konserwować urządzenia w inkubatorze.
- Użyj sterylnej pęsety i jednej końcówki, aby usunąć urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorzystą konfigurację neuronów. Użyj końcówki, aby przytrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu, a pęsety zacisnąć krawędź urządzenia w lewym dolnym rogu studni. Delikatnie przykręć urządzenie, podnosząc urządzenie pęsetą do góry, aby odkleiło się od szkiełka nakrywkowego. Patrz rysunek 3c-3d.
- Co 2-3 dni wymieniaj połowę NBM, aż próbka zostanie wykorzystana do eksperymentów.
- Przed wykonaniem eksperymentów z ponownym okablowaniem na próbce należy sprawdzić, czy neuryty w kanałach urządzenia z pojedynczą populacją i populacje neuronów w urządzeniu z wieloma populacjami są izolowane, badając przerwy między nimi w mikroskopie, aby upewnić się, że nie ma włókien łączących populacje neuronów.
5. Przygotowanie koralików pokrytych PDL
- Dodaj 2 krople po 50 μl 4, 10 lub 20 μm kulek polistyrenowych rozcieńczonych w wodzie (1:500) do 1 ml PDL (100 μg/ml). Pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu i wznowiony następnego dnia.
- Odwirować roztwór o stężeniu 8,820 x g przez 1 minutę. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek nagromadzonych na dnie pojemnika.
- Umyj kulki dwukrotnie 1 ml sterylnego 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.
- Zawiesić kulki pokryte PDL w 200 ml 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.
6. Przygotowanie mikropipet
- Przygotuj pipety ze szklanych rurek kapilarnych (średnica wewnętrzna 1 mm, średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą poziomego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia tak, aby zewnętrzna końcówka wyciągniętej mikropipety wynosiła ~ 2-5 μm. Przed pociągnięciem upewnij się, że szklane rurki są czyste.
- Przymocuj pipety do szkiełek podstawowych na czas przechowywania i upewnij się, że końcówka nie styka się z powierzchnią szkiełka, ponieważ końcówka jest delikatna. Przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pojemniku w celu ochrony przed kurzem. Pipet należy używać tego samego dnia, w którym zostały pobrane.
7. Adhezja PDL do neuronów
- Dodać 40-60 μl kulek pokrytych PDL przygotowanych w kroku 5 do kultury komórkowej przygotowanej w kroku 4. Wyśrodkuj końcówkę pipety nad neuronami, które są słabo widoczne na szkiełku nakrywkowym, i dodaj koraliki (patrz rysunek 4).
- Umieść próbkę z powrotem w inkubatorze na 1 godzinę, aby ułatwić tworzenie się kontaktów synaptycznych.
- Po inkubacji usuń wszelkie nieprzylegające kulki, delikatnie myjąc kulturę wstępnie podgrzanym NBM.
8. Przygotowanie fizjologicznego roztworu soli fizjologicznej (do eksperymentów w temperaturze pokojowej)
- Przygotuj fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej. Ma to na celu regulację środowiska komórkowego na zewnątrz inkubatora.
- Sprawdź osmolarność i poziom pH.
- Stale wlewaj roztwórO2, aby zminimalizować wahania pH podczas przeprowadzania eksperymentów.
- Podgrzać do temperatury pokojowej.
- Ustawić system perfuzji, wkładając jeden koniec plastikowej rurki (wymiary opcjonalne) do roztworu fizjologicznego z dodatkiemO2 i mocując drugi koniec do igły umieszczonej w uchwycie na próbkę. Umieść rurkę i roztwór wyżej niż sample (patrz rysunek 5).
- Odłączyć rurkę od igły i podłączyć ją do strzykawki. Za pomocą strzykawki wywrzeć nacisk i pobrać płyn, napełniając probówkę. Uszczelnić za pomocą zacisku rolkowego i ponownie podłączyć igłę.
9. Mikromanipulacja koralikami
- Umieścić próbkę w konfiguracji eksperymentalnej w taki sposób, aby dwie mikropipety zamontowane w mikropipetach mogły uzyskać dostęp do komórek od góry i uzyskać do nich dostęp optycznie poniżej, na przykład za pomocą obiektywu 40-fazowego (apertura numeryczna 0,6) odwróconego mikroskopu optycznego. W tej konfiguracji należy zamontować kamerę CCD do przechwytywania obrazu w bocznym porcie mikroskopu. Podłącz każdą pipetę do strzykawek o pojemności 1 ml za pomocą plastikowej rurki. Na tym etapie zastąp NBM roztworem soli fizjologicznej (1-2 ml) (patrz rysunek 5).
- Podczas eksperymentów komórki były w sposób ciągły perfundowane roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 8 z szybkością 0,5-1 ml/min.
- Wybierz koralik PDL, który NIE jest przyczepiony do neuronu w polu widzenia. Wyrównaj kulkę z końcówką mikropipety, skupiając się na kulce, a następnie w górę na mikropipecie. Przyłóż końcówkę jak najbliżej ściegu, monitorując ją przez mikroskop.
- Zastosuj podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do pipety, aby pobrać kulkę. Utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.
10. Ciągnięcie neurytów
- Wybierz kulkę PDL przyczepioną do neuronu w polu widzenia i podłącz ją do drugiej mikropipety za pomocą ssania, jak opisano w krokach 9.3-9.4.
- Powoli pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 1 μm i zatrzymując się na 5 minut, aby umożliwić inicjację neurytu.
- Powtórz krok 10.2 dwa razy.
Uwaga: Pierwsze 3 μm muszą być pobierane bardzo powoli, aby zagwarantować sukces eksperymentalny, który występuje w ponad 95% przypadków.
- Pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron, powoli (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 2 μm i zatrzymaj się na 5 minut, aby umożliwić wydłużenie neurytów.
- Po udanej inicjacji i rozciągnięciu neurytu przez pierwsze 5 μm, pociągnij neuryt z prędkością 20 μm/min na odległości w skali milimetrowej.
Uwaga: Ciągnięcie może odbywać się w sposób ciągły lub skokowo i z różną szybkością. Patrz rysunek 6b-6c.
11. Łączenie neuronów
- Wybierz region bogaty w neuryty i obniż kompleks PDL-koralik-neuryt, aby fizycznie się z nim stykał. Użyj innych ściegów, aby ocenić wysokość końcówki nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Zobacz rysunek 6d.
- Pozostawić kompleks PDL-kulka-neuryt w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzony neuryt około 20 μm od pierwszego koralika. Użyj drugiego koralika PDL, aby popchnąć nowe włókno neurytu w kierunku komórki docelowej.
- Przytrzymaj oba koraliki na miejscu przez co najmniej 1 godzinę. Sprawdź pod mikroskopem brak ogniskowego obrzęku, pogrubienia neurytów stykających się z koralikiem16.
- W tym czasie użyj perfuzji, aby powoli zmienić pożywkę próbki z soli fizjologicznej na wstępnie podgrzany, zrównoważony CO2 NBM.
- Zwolnij kulkę z drugiej pipety, zwalniając ssanie. Jeśli nowy neuryt pozostaje przyczepiony, zwolnij również pierwszą kulkę. Patrz rysunek 6e .
- Delikatnie usuń roztwór soli fizjologicznej i zastąp NBM (~2 ml).
- Ostrożnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne do przyszłych eksperymentów. To połączenie jest stabilne dla >24
