1. Przygotowanie fibroblastów skóry do przeprogramowania
- Za pomocą automatycznego systemu rozmrażania komórek lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C rozmrozić dorosłe ludzkie fibroblasty skórne (aHDF) i płytkę 200 000 na kolbę T75 (policz za pomocą automatycznego licznika komórek) w 10 ml pożywki fibroblastowej (patrz tabela 1) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Następnego dnia wykonaj całkowitą zmianę podłoża za pomocą pożywki fibroblastowej.
- Zmieniaj pożywkę fibroblastów co 3-4 dni, aż komórki osiągną 95% zbieżności.
nuta: Jedna kolba zlewająca się będzie zawierała około 1 000 000 komórek.
2. Poszycie do przeprogramowania (Dzień −1)
UWAGA: Zaleca się stosowanie żelatynowej powłoki do krótkoterminowych eksperymentów (do 30 dni); alternatywnie, dla długoterminowych eksperymentów zaleca się rozpoczęcie od powłoki z poli-L-ornityny, fibronektyny i lamininy (PFL).
- 60 minut przed posiewem aHDF w celu przeprogramowania, pokryć 24-dołkową płytkę 0,1% żelatyną (250 μl/basenik) i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Odessać pożywkę fibroblastową na aHDF. Przemyć raz roztworem soli fizjologicznej (DPBS) z buforem fosforanowym Dulbecco. Dysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny (1,5 ml na kolbę T75) w temperaturze 37 °C przez 3–5 minut.
- Dodać pożywkę fibroblastową, aby zneutralizować trypsynę (3 ml na płukanie na kolbę T75) i zebrać oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml, dwukrotnie wypłukując komórki w kolbie.
- Wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki fibroblastowej.
- Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (aby zapewnić dobrą jakość konwersji, sprawdź, czy żywotność komórek przekracza 90% w przypadku barwienia błękitem trypanowym).
- Aby uzyskać kompletną 24-dołkową płytkę, przygotuj zawiesinę 1 320 000 komórek w 13,2 ml pożywki fibroblastowej, aby uzyskać zawiesinę 100 000 komórek/ml pożywki (lub 55 000 komórek/basenik w 550 μl pożywki fibroblastowej pomnożonej przez liczbę potrzebnych studzienek).
- Odessać żelatynę z płytki i przemyć dwukrotnie DPBS. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
3. Transdukcja wirusa (Dzień 0)
UWAGA: Praca z cząstkami lentiwirusa wymaga sprzętu kategorii 2 i użycia środka do neutralizacji wirusa. Zdecydowanie zaleca się również noszenie podwójnych par rękawiczek.
- Rozgrzej 13,2 ml pożywki fibroblastowej do temperatury 37 °C.
- Rozmrozić wektor lentiwirusowy zawierający czynniki transkrypcyjne z rodziny achaete-scute czynnik transkrypcyjny bHLH 1 (Ascl1) i Brn2 za pomocą dwóch krótkich RNA spinki do włosów (shRNA) ukierunkowanych na czynnik transkrypcyjny wyciszający RE1 (REST) w temperaturze pokojowej.
- Dodać niezbędną objętość lentiwirusa do zakażenia aHDF przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 20 do pożywki bez żadnych wzmacniaczy transdukcji.
- Zastąpić pożywkę na płytce 24-dołkowej pożywką fibroblastową zawierającą wektor lentiwirusowy (500 μl/basenik) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
- Następnego dnia zastąp pożywkę w studzienkach świeżą pożywką fibroblastową bez wektora lentiwirusowego.
nuta: Pożywka jest uważana za zakaźną przez 7 dni, w związku z czym w pierwszym tygodniu po transdukcji wirusa należy zastosować odpowiednie procedury ochrony i obchodzenia się z nim.
4. Konserwacja komórek konwertujących
UWAGA: Gdy rozpocznie się konwersja, komórki są podatne na podnoszenie; uważaj, aby przechylić płytkę do góry i używać pipety o pojemności 1 000 μL podczas wyjmowania mediów, aby uniknąć oderwania komórek.
- W 3 dniu usuń pożywkę fibroblastów i dodaj 500 μl pożywki wczesnej konwersji neuronalnej (patrz Tabela 1).
- Dwa do trzech razy w tygodniu wyjmij 225 μl starej pożywki ze studzienki i dodaj 250 μl świeżej pożywki wczesnej konwersji neuronalnej.
- W dniu 18 usuń całą pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 500 μl pożywki z późną konwersją neuronalną (patrz Tabela 1).
- Kontynuuj zmianę połowy pożywki, jak powyżej, z pożywką z późną konwersją neuronalną co 2-3 dni, aż do 25 dnia lub punktu końcowego eksperymentu (Figura 1A).
Tabela 1. Skład różnych użytych mediów. Pełny opis składu dla pożywek potrzebnych w tym protokole, w tym pożywka fibroblastów, pożywka wczesnej konwersji neuronalnej, pożywka późnej konwersji neuronalnej.
powiedział:
| Koncentracja zapasów | Koncentracja robocza |
| Pożywka fibroblastowa |
| Podłoże podstawowe | N/a | N/a |
| Penicylina/Streptomycyna | 10 000 U/ml | 100 mg/ml |
| FBS (Sieć Usługowa | N/a | 10% |
| Wczesna pożywka konwersji neuronalnej (ENM) | |
| Ośrodek różnicowania neuronalnego | N/a | N/a |
| Penicylina/Streptomycyna | 10 000 U/ml | 100 mg/ml |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 μM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 μM |
| Kubek | 100 μg/ml | 0,5 μg/ml |
| Numer identyfikacyjny LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 μM |
| Dobrowolna umowa o partnerstwie | 1 mln | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 μM |
| Certyfikat GDNF | 20 μg/ml | 2 ng/ml |
| NT3 | 10 μg/ml | 10 ng/μL |
| db-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Późna pożywka neuronalna (LNM) | |
| Ośrodek różnicowania neuronalnego | N/a | N/a |
| Penicylina/Streptomycyna | 10 000 U/ml | 100 mg/ml |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 μM |
| Certyfikat GDNF | 20 μg/ml | 2 ng/ml |
| NT3 | 10 μg/ml | 10 ng/μL |
| db-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
