Generowanie neuronów poprzez przeprogramowanie ludzkich komórek fibroblastów skóry

Streszczenie

Źródło: Shrigley, S., et al. Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (2018)

Film pokazuje generowanie neuronów z dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych (aHDF). aHDF są przeprogramowywane przy użyciu wektora lentiwirusowego przenoszącego geny neuronalnych czynników transkrypcyjnych i krótkich RNA spinki do włosów (shRNA). ShRNA hamują ekspresję neuronalnego represora transkrypcyjnego, a neuronalne czynniki transkrypcyjne aktywują geny do różnicowania aHDF w neurony. Te przeprogramowane aHDF są hodowane we wczesnej i późnej pożywce konwersji neuronalnej w celu wytworzenia dojrzałych neuronów.

Protokół

1. Przygotowanie fibroblastów skóry do przeprogramowania

1. Za pomocą automatycznego systemu rozmrażania komórek lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C rozmrozić dorosłe ludzkie fibroblasty skórne (aHDF) i płytkę 200 000 na kolbę T75 (policz za pomocą automatycznego licznika komórek) w 10 ml pożywki fibroblastowej (patrz tabela 1) w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
2. Następnego dnia wykonaj całkowitą zmianę podłoża za pomocą pożywki fibroblastowej.
3. Zmieniaj pożywkę fibroblastów co 3-4 dni, aż komórki osiągną 95% zbieżności.
   nuta: Jedna kolba zlewająca się będzie zawierała około 1 000 000 komórek.

2. Poszycie do przeprogramowania (Dzień −1)

UWAGA: Zaleca się stosowanie żelatynowej powłoki do krótkoterminowych eksperymentów (do 30 dni); alternatywnie, dla długoterminowych eksperymentów zaleca się rozpoczęcie od powłoki z poli-L-ornityny, fibronektyny i lamininy (PFL).

1. 60 minut przed posiewem aHDF w celu przeprogramowania, pokryć 24-dołkową płytkę 0,1% żelatyną (250 μl/basenik) i inkubować w temperaturze 37 °C.
2. Odessać pożywkę fibroblastową na aHDF. Przemyć raz roztworem soli fizjologicznej (DPBS) z buforem fosforanowym Dulbecco. Dysocjować komórki za pomocą 0,05% trypsyny (1,5 ml na kolbę T75) w temperaturze 37 °C przez 3–5 minut.
3. Dodać pożywkę fibroblastową, aby zneutralizować trypsynę (3 ml na płukanie na kolbę T75) i zebrać oderwane komórki do probówki o pojemności 15 ml, dwukrotnie wypłukując komórki w kolbie.
4. Wirować komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml pożywki fibroblastowej.
5. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (aby zapewnić dobrą jakość konwersji, sprawdź, czy żywotność komórek przekracza 90% w przypadku barwienia błękitem trypanowym).
6. Aby uzyskać kompletną 24-dołkową płytkę, przygotuj zawiesinę 1 320 000 komórek w 13,2 ml pożywki fibroblastowej, aby uzyskać zawiesinę 100 000 komórek/ml pożywki (lub 55 000 komórek/basenik w 550 μl pożywki fibroblastowej pomnożonej przez liczbę potrzebnych studzienek).
7. Odessać żelatynę z płytki i przemyć dwukrotnie DPBS. Dodać 500 μl zawiesiny komórkowej do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .

3. Transdukcja wirusa (Dzień 0)

UWAGA: Praca z cząstkami lentiwirusa wymaga sprzętu kategorii 2 i użycia środka do neutralizacji wirusa. Zdecydowanie zaleca się również noszenie podwójnych par rękawiczek.

1. Rozgrzej 13,2 ml pożywki fibroblastowej do temperatury 37 °C.
2. Rozmrozić wektor lentiwirusowy zawierający czynniki transkrypcyjne z rodziny achaete-scute czynnik transkrypcyjny bHLH 1 (Ascl1) i Brn2 za pomocą dwóch krótkich RNA spinki do włosów (shRNA) ukierunkowanych na czynnik transkrypcyjny wyciszający RE1 (REST) w temperaturze pokojowej.
3. Dodać niezbędną objętość lentiwirusa do zakażenia aHDF przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 20 do pożywki bez żadnych wzmacniaczy transdukcji.
   
4. Zastąpić pożywkę na płytce 24-dołkowej pożywką fibroblastową zawierającą wektor lentiwirusowy (500 μl/basenik) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ .
5. Następnego dnia zastąp pożywkę w studzienkach świeżą pożywką fibroblastową bez wektora lentiwirusowego.
   nuta: Pożywka jest uważana za zakaźną przez 7 dni, w związku z czym w pierwszym tygodniu po transdukcji wirusa należy zastosować odpowiednie procedury ochrony i obchodzenia się z nim.

4. Konserwacja komórek konwertujących

UWAGA: Gdy rozpocznie się konwersja, komórki są podatne na podnoszenie; uważaj, aby przechylić płytkę do góry i używać pipety o pojemności 1 000 μL podczas wyjmowania mediów, aby uniknąć oderwania komórek.

1. W 3 dniu usuń pożywkę fibroblastów i dodaj 500 μl pożywki wczesnej konwersji neuronalnej (patrz Tabela 1).
2. Dwa do trzech razy w tygodniu wyjmij 225 μl starej pożywki ze studzienki i dodaj 250 μl świeżej pożywki wczesnej konwersji neuronalnej.
3. W dniu 18 usuń całą pożywkę z każdej studzienki i zastąp ją 500 μl pożywki z późną konwersją neuronalną (patrz Tabela 1).
4. Kontynuuj zmianę połowy pożywki, jak powyżej, z pożywką z późną konwersją neuronalną co 2-3 dni, aż do 25 dnia lub punktu końcowego eksperymentu (Figura 1A).

Tabela 1. Skład różnych użytych mediów. Pełny opis składu dla pożywek potrzebnych w tym protokole, w tym pożywka fibroblastów, pożywka wczesnej konwersji neuronalnej, pożywka późnej konwersji neuronalnej.

powiedział:

	Koncentracja zapasów	Koncentracja robocza
Pożywka fibroblastowa
Podłoże podstawowe	N/a	N/a
Penicylina/Streptomycyna	10 000 U/ml	100 mg/ml
FBS (Sieć Usługowa	N/a	10%
Wczesna pożywka konwersji neuronalnej (ENM)
Ośrodek różnicowania neuronalnego	N/a	N/a
Penicylina/Streptomycyna	10 000 U/ml	100 mg/ml
CHIR99021	10 mM	2 μM
SB-431542	20 mM	10 μM
Kubek	100 μg/ml	0,5 μg/ml
Numer identyfikacyjny LDN-1931189	10 mM	0,5 μM
Dobrowolna umowa o partnerstwie	1 mln	1 mM
LM-22A4	20 mM	2 μM
Certyfikat GDNF	20 μg/ml	2 ng/ml
NT3	10 μg/ml	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM
Późna pożywka neuronalna (LNM)
Ośrodek różnicowania neuronalnego	N/a	N/a
Penicylina/Streptomycyna	10 000 U/ml	100 mg/ml
LM-22A4	20 mM	2 μM
Certyfikat GDNF	20 μg/ml	2 ng/ml
NT3	10 μg/ml	10 ng/μL
db-cAMP	50 mM	0,5 mM

Wyniki

Rysunek 1: Ewolucja konwersji iN w czasie.(A) Oś czasu eksperymentu i mapa konstruktu zapakowanego w lentiwirusa używanego do przeprogramowania fibroblastów skóry dorosłego człowieka. Każda strzałka reprezentuje średnią zmianę. (B) Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego przedstawiające zmiany w morfologii komórek podczas procesu konwersji między dniem 0 a dniem 2...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Linie komórkowe
Fibroblasty skóry dorosłego człowieka			[C2 fragment #7] Dawcą była 67-letnia kobieta. Komórki uzyskane z klinik Badań nad Chorobą Parkinsona i Chorobą Huntingtona w John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, Wielka Brytania).
Odczynniki do hodowli, transdukcji i konwersji fibroblastów
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco (firma Gibco)	14190094
Trypsyna-EDTA [0,5%]	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15400-054	Rozcieńczyć do 0,05% w DPBS.
Virkon (środek stosowany do neutralizacji wirusa)	Wirusoderm	Numer telefonu 7511	Rozcieńczyć do 1% roztworu ciepłą wodą.
Woda Milli-Q	Milipory
Podłoże podstawowe - Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax	Gibco (firma Gibco)	61965059
Penicylina/Streptomycyna [10 000 U/ml]	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10270-106
CryoMACS® dimetylosulfotlenek (DMSO) 10	Miltenyi Miltenyi	tel. 170-076-303
Ośrodek różnicowania neuronalnego - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
LM-22A4	Tocris powiedział:	Numer katalogowy: 4607	Rozcieńczyć 10 mg w 1450 μL DMSO. Stężenie kolby: 20 mM.
Czynnik neurotroficzny pochodzenia komórkowego gleju (GDNF) [rekombinowany człowiek]	Systemy badawczo-rozwojowe	212-GD-010	Rozcieńczyć 10 ug w 500 μl 0,1% BSA w DPBS. Stężenie podstawowe: 20 μg/ml.
NT3 [człowiek rekombinowany]	Systemy badawczo-rozwojowe	267-N3-025	Rozcieńczyć 25 μg w 2,5 ml 0,1% BSA w DPBS. Stężenie podstawowe: 10 μg/ml.
db-cAMP	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D0627	Rozcieńczyć 1 g w 40,7 ml wody Milli-Q. Przefiltrować i przygotować 500 μl porcji lub probówki po 10 ml. Koncentracja kolby: 50 mM.
CHIR99021	akson	1386	Rozcieńczyć 2 μg w 429,8 μl DMSO. Stężenie kolby: 10 mM.
Numer identyfikacyjny LDN-193189	akson	Rok 1509	Rozcieńczyć 2 mg w 360 μl DMSO. Stężenie kolby: 10 mM.
Sól sodowa kwasu walproinowego (VPA)	Merck Millipore	Numer katalogowy: 676380	Rozcieńczyć 5 g w wodzie Milli-Q do uzyskania stężenia wyjściowego 1 M. UWAGA: Unikać połknięcia, kontaktu ze skórą i wdychania pylenia.
Odczynniki do powłok
żelatyna	Sigma Aldrich	Gwint G2500	Rozcieńczyć do 0,1% w wodzie Milli-Q.
Poli-L-ornityna	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P3655	Rozpuścić w wodzie Milli-Q. Stosować w dawce 15 μg/ml.
Fibronektyna	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 33010-018	2 ml wody Milli-Q + 70 μL 0,25 M NaOH. Stosować w dawce 5 μg/ml.
Laminina	ThermoFisher Naukowy	23017-015	Przechowywać w temperaturze -80°C. Rozmrozić na lodzie, schłodzić i porcjować 30 μl. Stosować w stężeniu 5 μg/ml.
sprzęt
Kolba T75 [Nunclon Delta Surface]	ThermoFisher Naukowy	156499
Płytka 24-dołkowa [Nunc]	ThermoFisher Naukowy	142485
Probówka polipropylenowa 1,5 ml	Sigma Aldrich	Z336769
15 ml probówka sokoła	Sarstedt	6,25,54,502
50 ml probówka sokoła	Sarstedt	6,25,47,254
Kontroler Pippette			Do pipetowania objętości 1-25 ml.
Sterylne pipety serologiczne: 5, 10 i 25 ml	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Pipety o regulowanej objętości: 5, 20, 200 i 1 000 μL
Sterylne końcówki do pipet			Do pipetowania objętości 0,5 - 1 000 μl.
Zautomatyzowany system rozmrażania komórek ThawSTAR	BioCision	Zobacz materiał BCS-601
Hrabina II Automatyczny licznik komórek	ThermoFisher Naukowy	AMQAX1000
Komory do zliczania komórek [50 szkiełek] i błękit trypanowy [0,4%]	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał C10228	Do użytku z automatycznym licznikiem komórek Countess II.
Okap z przepływem laminarnym
Nawilżony inkubator 5% CO2 37 °C
wirówka			Nadaje się do probówek o pojemności 1,5, 15 i 50 ml.
Wytrząsarka orbitalna
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Księga Leica	DMI6000 B