Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie do wstępnego krojenia
- Przygotuj pożywkę do "przetwarzania tkanek" i pożywkę do konserwacji kultur plastrowych na dzień przed planowaną resekcją guza i pobraniem tkanek (lub zutylizuj wcześniej wygenerowane podłoża w ciągu 2 tygodni). Dodać 5 ml roztworu penicyliny-streptomycyny (10 000 j./ml) i 5 ml 1 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) do 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, aby wytworzyć pożywkę do przetwarzania tkanek.
- Przygotuj 250 ml pożywki podtrzymującej kulturę w plastrach, używając bazy z pożywki neuronalnej (np. Neurobasal) bez czerwieni fenolowej. Uzupełnij tę pożywkę 10 mM HEPES, 1x suplement B-27, 400 μM L-glutaminy, 600 μM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy, 60 U/ml penicyliny, 60 μg/ml streptomycyny i 6 U/ml nystatyny.
- Przechowuj wszystkie nośniki w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 2 tygodnie.
2. Dzień operacji: Pobranie tkanek
- W dniu pobrania tkanek należy przygotować 50 - 100 ml 1% i 2% (wag./obj.) roztworów agarozy o niskiej temperaturze topnienia w pożywkach do przetwarzania tkanek przy użyciu autoklawowanego szkła i sterylnej techniki w okapie z przepływem laminarnym. Oba stężenia agarozy są potrzebne, aby dostosować się do nieprzewidywalnych zmian w konsystencji tkanki nowotworowej.
- Podgrzej zawiesinę agarozy za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż do uzyskania delikatnego wrzenia. Umieścić roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aby utrzymać go w stanie ciekłym do momentu użycia.
- Umieść 1 ml pożywki do konserwacji kultur w plasterkach w każdym dołku na 6-dołkowej płytce.
- Użyj sterylnych kleszczyków, aby umieścić puste wkładki hodowlane z politetrafluoroetylenu (PTFE) w każdym dołku. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych z płaszczem wodnym w atmosferze 5% CO2 utrzymywanej w temperaturze 37 °C.
- Używając sterylnej pipety Pasteura w okapie z przepływem laminarnym, wlej mieszaninę 95% O2/5% CO2 do kolby zawierającej lodowato zimne podłoże do przetwarzania tkanek przez około 15 do 30 minut, przed pobraniem tkanki nowotworowej. Zastosowanie pożywek supra-tlenowych minimalizuje niedotlenienie w tkance masowej podczas przetwarzania.
- Przygotuj znakowane stożkowe probówki o pojemności 50 ml (wystarczające do wyizolowania pożądanej liczby pojedynczych regionów guza) zawierające 20 ml podwielokrotności supra-utlenionego, lodowatego podłoża do przetwarzania w celu transportu tkanki między salą operacyjną a zakładem krojenia.
- We współpracy z neurochirurgiem zaplanuj przedoperacyjnie obszar guza w celu pobrania próbki. Wybierz region guza ze wzmocnieniem kontrastu, jak wykazano w obrazowaniu klinicznym pacjenta (sekwencje rezonansu magnetycznego T1 po gadolinie (MRI)). Wcześniejsze doświadczenia sugerują, że w tym obszarze powstaje żywotna tkanka nowotworowa, a nie tkanka martwicza.
nuta: Podjęto próbę wytworzenia wycinków z otaczającej (okołonowotworowej) istoty białej; Jednak autofluorescencja tła i zmniejszona gęstość komórek nowotworowych ograniczyły eksperymentalną użyteczność tych wycinków.
- Uzyskaj tkankę nowotworową na początku resekcji guza. Należy unikać pobierania tkanki nowotworowej narażonej na rozległą kauteryzację dwubiegunową, która może zagrozić żywotności tkanek wtórnie do urazu termicznego. Próbki tkanek pobrane podczas fragmentarycznej resekcji guza wykazują zwiększoną żywotność w porównaniu z tkankami uzyskanymi z długotrwałych resekcji en bloc. Obserwacja ta może dotyczyć różnicowego pozbawienia przepływu krwi w tkance nowotworowej w wyniku resekcji chirurgicznej i wydłużonego czasu do pozyskania.
- W razie potrzeby oznacz i przechowuj tkankę nowotworową w oddzielnych stożkowych probówkach, aby wyizolować próbki z różnych regionów guza. (tj. powierzchowna vs. głęboka tkanka nowotworowa). Dokładne lokalizacje tkanek mogą być rejestrowane, jeśli/kiedy dostępna jest śródoperacyjna nawigacja chirurgiczna.
3. Przygotowanie kultury plastrów
- Umieść fragmenty tkanki nowotworowej na szalce Petriego z lodowatym podłożem do obróbki. Aby umyć tkankę nowotworową i zminimalizować przylegające czerwone krwinki, użyj pipety, aby delikatnie wymienić i trzykrotnie wyrzucić pożywkę na szalce Petriego.
- Za pomocą skalpela pokrój kawałki guza w prostokątne kształty pudełek. Przytnij kawałki tkanki do około 3 mm x 3 mm x 10 mm. Ostrożnie usuń wszelkie przyczepione naczynia poprzez wycięcie lub delikatne pociągnięcie drobnymi kleszkami.
- Odpipetować 5 - 7 ml agarozy o temperaturze 37 °C do małej plastikowej formy w kształcie sześcianu (~ 2 cm3). Przed użyciem potwierdzić temperaturę roztworu agarozy nie wyższą niż 37 °C za pomocą sterylnego termometru.
- Pozostaw agarozę na około 1 minutę na lodzie.
- Umieść 2 - 4 "paski" tkanki nowotworowej w agarozie z długą osią zorientowaną pionowo. nuta: Paski tkankowe będą miały tendencję do "zapadania się" w agarozie przed zestaleniem. Aby uniknąć tego powikłania, tymczasowo przytrzymaj pasek tkanki w orientacji pionowej, aż agaroza zostanie dalej zestalona.
- Chusteczkę zawierającą pleśń agarozową należy przechowywać na lodzie przez 2 - 5 minut, aby ułatwić krzepnięcie.
- Usuń pleśń z lodu i delikatnie usuń blok agarozy, przecinając boki formy skalpelem. Unikaj wywierania nadmiernej siły na blok, ponieważ może to spowodować pęknięcie agarozy.
- Użyj dużej kropli kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować blok agarozy do płytki próbki wibratomu. Pozostaw klej na około 1 - 2 minuty.
- Napełnij zbiornik wibratomu lodowatym medium do obróbki, aby zanurzyć blok agarozy przymocowany do płytki próbki.
- Podczas krojenia wlej mieszaninę 95% gazu O2 / 5% CO2 do zbiornika wibratomu za pomocą przyciętej sterylnej plastikowej pipety.
- Ustaw grubość plastra wibratomu na 300 - 350 μm.
- Dostosuj prędkość posuwu ostrza i amplitudę ostrza w zależności od konsystencji tkanki. "Sztywniejsza" tkanka glejaka wymaga wolniejszych prędkości posuwania się ostrza i wyższej amplitudy. Dokładne ustawienia prędkości i amplitudy ostrza będą się różnić w zależności od specyfikacji wibratomu.
nuta: Podczas krojenia często pojawia się kilka problemów. Jeśli pasek tkanki odsunie się od bloku agarozy, spróbuj osadzić tkankę w agarozie o wyższym stężeniu. Jeśli plastry guza są grubsze niż pożądane (zestaw maszynowy) lub są asymetryczne, zwiększ amplitudę i zmniejsz prędkość ostrza wibratomu. Aby upewnić się, że tkanka nowotworowa nie jest przyklejana ani "ciągnięta" przez uchwyt ostrza, podczas krojenia, ostrożnie umieść mikroszpatułkę między uchwytem ostrza a plastrem, gdy ostrze się porusza.
- Przenieś plastry tkanek na szalkę Petriego za pomocą lodowatego podłoża technologicznego za pomocą mikroszpatułki ze stali nierdzewnej.
- Otrzymać 6-dołkowe płytki zawierające wkładki PTFE i zrównoważone warstwy pożywki hodowlanej z inkubatora (jak przygotowano w sekcji 2, krok 4).
- Plastry tkanki na płytkę za pomocą mikroszpatułki ze stali nierdzewnej. Zminimalizuj bezpośredni kontakt i manipulację tkanką, używając małego pędzla z cienkim włosiem, aby wygenerować "falę płynu", aby delikatnie zepchnąć plasterek ze szpatułki na wkładkę hodowlaną.
nuta: Zminimalizuj ilość pożywki procesowej wprowadzanej na wkładkę do hodowli tkankowej. Jeśli przenoszone są nadmierne ilości pożywki, co powoduje unoszenie się plastrów na wodzie, użyj sterylnej pipety Pasteura, aby usunąć pożywkę.
- Umieścić 6-dołkowe płytki zawierające plastry guza z powrotem do inkubatora utrzymywanego w temperaturze 37 °C z 5% atmosferąCO2.
nuta: Cały protokół osadzania i krojenia powinien zostać zakończony w ciągu 90 minut od pobrania tkanki nowotworowej z sali operacyjnej.
4. Utrzymanie kultury Slice
- Po 12 - 24 godzinach przenieś kultury plastrów, chwytając każdą krawędź wkładki sterylnymi kleszczami, a następnie przenieś na płytki zawierające świeże podłoża do konserwacji kultur plastrów. Upewnij się, że pożywka do konserwacji kultur warstwowych podzielona na porcje do każdej studzienki równoważy się w inkubatorze przez co najmniej 15 minut przed przeniesieniem wkładek.
- Co 48 godzin należy przenosić wkładki na nowe płytki 6-dołkowe ze świeżymi, zrównoważonymi pożywkami do hodowli warstwowych.
- W razie potrzeby należy podwielokrotnić starą pożywkę hodowlaną w warstwach za pomocą pipety do natychmiastowego użycia w testach biochemicznych lub zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
