Opracowanie modelu potrójnej hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg

Streszczenie

Źródło: Fattakhov, N., et al. Potrójny pierwotny model hodowli komórkowej ludzkiej bariery krew-mózg do badania udaru niedokrwiennego in vitro. J. Vis. Exp.(2022)

Ten film pokazuje współhodowlę komórek ludzkiego mózgu perycytów, astrocytów i śródbłonka. Każda warstwa komórkowa jest tworzona oddzielnie, a następnie hodowana razem, tworząc trójwarstwowy system, który naśladuje układ komórkowy bariery krew-mózg

Protokół

1. Ustawienie modelu BBB z potrójną hodowlą komórkową

1. Wysiew perycytów
   1. Hodować HBVP (perycyty naczyniowe ludzkiego mózgu) w kolbach hodowlanych T75 z aktywowaną powierzchnią do adhezji komórek w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C aż do zlewania się. Po osiągnięciu konfluencji odessać starą pożywkę perycytową i przemyć komórki 5 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco. Odessać DPBS i odłączyć komórki od kolby, używając kombinacji 4 ml ciepłego roztworu trypsyny-EDTA i 1 ml DPBS.
      UWAGA: Unikaj używania fragmentów późniejszych niż P7.
   2. Inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO_{2 .} Obejrzeć pod mikroskopem, aby potwierdzić, czy komórki są odłączone od kolby. Dodać 5 ml ciepłej pożywki dla perycytów (zawierającej 2% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) do kolby i przenieść oderwane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
   3. Odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty w temperaturze 200 × g, pozwalając komórkom utworzyć osad na dnie probówki. Odessać pożywkę z probówki, upewniając się, że osad komórek pozostaje nienaruszony.
   4. Zawiesić osad komórkowy w pożywce perycytowej; obliczyć ilość pożywki w zależności od zbiegu komórek i liczby potrzebnych wkładek studzienek. Weź 10 μl zawieszonych komórek, umieść je na szkiełku do liczenia komórek i policz liczbę komórek.
   5. Określ gęstość komórek i wysiewaj 300 000 komórek/wstawkę w 1 ml pożywki perycytowej po abluminalnej stronie wkładek studzienek (format 6-dołkowy).
      nuta: Podczas wysiewu HBVP na spodniej stronie wkładek ważne jest, aby odwrócić płytki dobrze włożone do góry nogami. Podczas gdy płytka jest ułożona płasko na powierzchni, zdejmij dolną część, aby odsłonić abluminatyczną stronę wkładów studzienek. Przykryj wkładki studzienki odwróconą płytką po dodaniu zawiesiny komórek perycytów po stronie abluminalnej, aby zapobiec parowaniu. Przechowywać wszystkie płytki odwrócone do góry nogami w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez noc.
2. Wysiewanie astrocytów
   1. Hodować HA (ludzkie astrocyty) w kolbach T75 w inkubatorze z 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia konfluencji. Wykonaj powyższe kroki 1.1.1-1.1.4, używając pożywki astrocytowej (również zawierającej 2% FBS) zamiast pożywki perycytowej.
      UWAGA: Unikaj używania fragmentów późniejszych niż P9.
   2. Określ gęstość komórek i wysiew 300 000 komórek/studzienka na dnie 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej. Przykryj płytkę, aby zapobiec parowaniu i przechowuj wszystkie płytki w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez noc.
3. Wysiewanie komórek śródbłonka
   1. Hodować HBMEC (ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego) w naczyniach do hodowli tkankowych w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C aż do zlania. Wykonaj powyższe kroki 1.1.1-1.1.4, używając kompletnej klasycznej pożywki (zawierającej 10% FBS) zamiast pożywki perycytowej.
      nuta: Unikaj używania fragmentów późniejszych niż P12.
   2. Wyjąć 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych zawierające astrocyty i wkładki studzienkowe (format 6-dołkowy) zawierające perycyty z inkubatora 5% CO₂ w temperaturze 37 °C. Odessać pożywkę astrocytów z 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Dodaj 1 ml pożywki perycytowej i 1 ml pożywki astrocytów do każdej studzienki.
   3. Odessać pożywkę perycytową z wkładek studzienek i umieścić ją w 6-dołkowych płytkach do hodowli tkankowych zawierających astrocyty z nasionami. Wysiewać HBMEC o gęstości 300 000 komórek/studzienkę w 2 ml kompletnego klasycznego podłoża na wierzchołkową stronę tych samych wkładek studzienkowych.
      nuta: Komórki śródbłonka należy wysiać po wierzchołkowej stronie wkładów studzienkowych następnego dnia po wysianiu perycytów po stronie abluminalnej wkładów studzienek i astrocytów na płytkach 6-dołkowych do hodowli tkankowych. Komórki powinny być utrzymywane w potrójnej hodowli przez sześć dni, aby wywołać właściwości podobne do BBB. Pożywkę do hodowli komórkowych należy zmienić w obu dobrze włożonych komorach na 24 godziny przed eksperymentem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
24 mm Transwell z wkładką membrany poliestrowej o porach 0,4 μm	Corning	3450
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm	MatTek Nauki Przyrodnicze (FISHERSCI)	Zobacz materiał P35GC-1.5-14-C
Pożywka astrocytów	Komórka Naukowa	Rok 1801
Współczynnik przywiązania	Systemy komórkowe (Fisher Scientific)	4Z0-201
Kompletny Classic Medium z serum i CultureBoost	4Z0-500	Systemy komórkowe
Probówki wirówkowe Corning 50 ml PP (stożkowe dno z nasadką CentriStar	Firma VWR	430829
Corning 75cm² Skośna szyjka w kształcie litery U nie poddana obróbce Kolba do hodowli komórkowych	Corning	431464U
Corning CellBIND 96-dołkowe płaskie przezroczyste dno z czarnym polistyrenem	Corning	3340
Szkiełka komory zliczania komórek Countes	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C10228
Countess II FL Automatyczny licznik komórek	Thermo Fisher Naukowy	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM Medium (bez glukozy, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej)	Rybak termiczny	A14430-01	Pożywka wolna od glukozy
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)	Rybak termiczny	14190250
EBM Pożywka podstawowa do wzrostu komórek śródbłonka, bez czerwieni fenolowej, 500 ml	Lonza	Zobacz materiał CC-3129
Inkubator CO2
wirówka