$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Synteza żelatyny metakryloylu (GelMA)
- Odważyć 10 g żelatyny otrzymanej ze skóry świni i rozpuścić w 100 ml PBS, pozostawiając roztwór mieszany na płycie grzewczej z prędkością 240 obr./min i w temperaturze 50 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Pod maską dodać 2 ml bezwodnika metakrylowego (MA) w celu uzyskania niskiego stopnia funkcjonalizacji i pozostawić emulsję żelatynową mieszającą się z prędkością 240 obr./min i 50 °C przez 2 godziny
ostrożność: Zwrot wskazujący rodzaj zagrożenia: H302 + H332 (działa szkodliwie po połknięciu lub wdychaniu ), H311 (działa toksycznie w kontakcie ze skórą), 314 (powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu), 315 (działa drażniąco na skórę), H317 (może powodować reakcję alergiczną skóry), H318 (powoduje poważne uszkodzenie oczu), 331 (działa toksycznie w następstwie wdychania), H332 (działa szkodliwie w następstwie wdychania), H335 (może powodować podrażnienie dróg oddechowych). Wskazówki dotyczące obchodzenia się z produktem: P261 (unikać wdychania pyłu/dymu/gazu/mgły/par/rozpylonej cieczy), P305 + P351 + P338 + P310 (W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: Ostrożnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjmij soczewki kontaktowe, jeśli są i są łatwe do usunięcia. Kontynuuj płukanie. Natychmiast skontaktuj się z OŚRODKIEM ZATRUĆ/lekarzem), P301 + P312 + P330 (W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Zadzwoń do OŚRODKA ZATRUĆ/lekarza, jeśli źle się czujesz. Wypłukać usta).
nuta: Dodawaj MA bardzo powoli, kropla po kropli.
- Rozcieńczyć roztwór żelatyny-MA w 100 ml podgrzanego PBS (50 °C) do uzyskania 200 ml końcowej objętości i pozostawić roztwór mieszać przy 240 obr./min i 50 °C przez 10 minut.
- Odetnij ~20 cm membrany dializacyjnej (odcięcie molekularne 12-14 kDa) i namocz ją w wodzie dejonizowanej, aż stanie się miękka.
nuta: Napełnij membrany wodą dejonizowaną, aby upewnić się, że nie ma ani defektów.
- Za pomocą lejka przenieść roztwór żelatyny-MA do membran.
nuta: Zamknij obie strony, pozostawiając dodatkową przestrzeń w środku, aby umożliwić mieszanie.
- Umieścić membrany zawierające roztwór żelatyny-MA w pojemniku zawierającym 2 litry wody destylowanej do dializy i pozostawić na mieszanie w temperaturze 40 °C przez 5 dni (500 obr./min).
nuta: Przykryj pojemnik, aby uniknąć parowania wody.
- Zmieniaj wodę destylowaną dwa razy dziennie. Za każdym razem odwróć membrany do góry nogami w celu homogenizacji.
- Piątego dnia zmieszać 200 ml podgrzanej ultraczystej wody (40 °C) z dializowaną żelatyną-MA i mieszać przez 15 minut w temperaturze 40 °C.
- Przenieść roztwór żelatyny-MA do 50 ml stożkowych probówek o objętości do 25 ml i pozostawić probówki w temperaturze -80 °C na 2 dni.
nuta: Przechowuj probówki poziomo, aby ułatwić liofilizację.
- Zamrożone roztwory należy liofilizować przez 3-5 dni i przechowywać liofilizowany GelMA w chronionym miejscu przed wilgocią.
2. Przygotowanie biotuszu
UWAGA: Aby uzyskać 1 ml biotuszu, zaleca się wyprodukowanie co najmniej 3 ml roztworu biomateriału, ponieważ mogą wystąpić straty podczas filtracji.
- Przygotowanie roztworu fibrynogenu
- Przygotować roztwór soli fizjologicznej (NaCl 0,9%) w wodzie dejonizowanej i rozpuścić 10 mg fibrynogenu z osocza bydlęcego w 1 ml roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie 10 mg/ml.
nuta: Ponieważ fibrynogen adsorbuje się ze szkłem, nie należy używać szklanych kolb do przygotowania roztworu fibrynogenu.
- Pozostawić roztwór pod mieszaniem w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia fibrynogenu.
UWAGA: Do rozpuszczenia fibrynogenu należy użyć systemu obrotowego umieszczonego w piekarniku w temperaturze 37 °C. Odpowiednie jest również mieszanie magnetyczne (180 obr./min) fibrynogenu na płycie grzejnej w temperaturze 37 °C. W tych warunkach 10 mg/ml fibrynogenu rozpuszcza się po około 40 minutach.
- Przygotowanie roztworu żelatyny/GelMA
- Odważyć 0,12 g żelatyny i dodać ją do 1,9 ml podgrzanego PBS (40 °C) do uzyskania końcowego stężenia 4% (w/v) żelatyny. Wir ułatwiający rozpuszczanie.
- Przechowywać emulsję w temperaturze 40 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Odważyć 0,06 g liofilizowanego GelMA i przenieść go do roztworu żelatyny, aby uzyskać końcowe stężenie 2% (w/v) GelMA. Wir ułatwiający rozpuszczanie.
- Roztwór należy przechowywać w temperaturze 40 °C aż do całkowitego rozpuszczenia.
3. Przygotowanie żelatyny z astrocytami/GelMA/biotuszu fibrynogenu
- Odpipetować 0,9 ml roztworu fibrynogenu o stężeniu 10 mg/ml i przenieść do roztworu żelatyny/GelMA, aby uzyskać końcowe stężenie 3 mg/ml fibrynogenu.
- Odważyć 0,015 g fotoinicjatora (PI) i przenieść do roztworu żelatyny/GelMA/fibrynogenu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5% (w/v) PI. Wymieszaj roztwór, obracając probówkę w górę i w dół i utrzymuj ją w temperaturze 40 °C, chroniąc przed światłem, aby uniknąć degradacji PI.
nuta: Tusz do biotuszu należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny.
- Pod przepływem laminarnym przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,2 μm do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
nuta: Roztwór biomateriału powinien mieć temperaturę 37-40 °C, aby umożliwić filtrację.
- Przenieść 980 μl roztworu biomateriału do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Rozcieńczyć lamininę w roztworze soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór podstawowy 100 μg/ml.
- Pobrać pipetą 20 μl lamininy i przenieść do probówki zawierającej biotusz, aby uzyskać końcowe stężenie 2 μg/ml lamininy.
- Mieszaj delikatnie, pipetując w górę i w dół, unikając pęcherzyków. Jeśli pozostaną jakiekolwiek pęcherzyki, odwirować stożkową probówkę o masie 200 x g przez 2 minuty. Przechowywać biotusz w temperaturze 37 °C, aż zostanie zmieszany z komórkami.
- Trypsynizuj pierwszorzędowe astrocyty 0,05% trypsyny przez 5 min.
nuta: Użyj astrocytów z przejść od 1 do 3.
- Zneutralizuj aktywność trypsyny za pomocą FBS w stosunku 1:1 i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
- Policz komórki i przenieś 1 x 106 komórek do innej stożkowej probówki. Odwirować przy 200 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant pozostawiając niewielką objętość (~200 μl) w celu zawieszenia osadu komórkowego, delikatnie stukając w spód stożkowej rurki.
- Przenieść 1 ml roztworu żelatyny/GelMA/fibrynogenu do probówki zawierającej komórki i delikatnie pipetować w górę i w dół do homogenizacji, uzyskując końcowe stężenie 1 x 106 komórek/ml.
3. Przygotowanie rozwiązania sieciującego
- Rekonstytucja trombiny
- Przygotować podstawowy roztwór trombiny 100 j./ml w sterylnej wodzie dejonizowanej z 0,1% (w/v) albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Zapas w mikroprobówkach w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Ponieważ trombina adsorbuje się na szkle, nie należy używać szklanych kolb do przygotowania roztworu podstawowego lub przechowywania podwielokrotności.
- Przygotowanie roztworu trombiny-CaCl2
- Pobrać pipetą 100 μl roztworu podstawowego trombiny i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 8,9 ml sterylnej wody dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 j./ml trombiny.
- Przygotować 10% (w/v) roztwór CaCl2 w wodzie dejonizowanej i wysterylizować za pomocą filtra 0,2 μm.
- Przenieść 1,1 ml 10% roztworu CaCl2 do stożkowej probówki zawierającej trombinę w celu uzyskania końcowego stosunku 1:9 (CaCl2 do trombiny).
nuta: Przygotuj roztwór sieciujący w woluminie do eksperymentu, unikając przechowywania.
4. Bioprinting biotuszu z ładunkiem astrocytów za pomocą biodrukarki opartej na ekstruzji
- Projektowanie tkanki nerwowej
- Korzystając z kodu G: skonstruuj siatkę o wymiarach 6 x 6 mm (kształt kwadratowy) z odległością 1 mm między każdą linią drukowaną na osi X i Y oraz 6 warstwami na osi Z (0,2 mm między każdą linią); ustaw wyciągnięcie (E) na 0,01 mm, zwiększając 0,001 mm na każdej nowej warstwie osi Z; i ustaw prędkość drukowania (F) na 400 mm/min (informacje dodatkowe).
- Konfiguracja biodrukarki
- Wystaw maszynę na działanie promieni UV przez 15 minut, a następnie przetrzyj ją etanolem 70%.
- Włącz biodrukarkę za pomocą wyłącznika zasilania. Podłącz urządzenie do komputera za pomocą USB. Otwórz oprogramowanie sterujące, aby podłączyć je do biodrukarki i załaduj projekt pliku.
- Przygotowanie strzykawki do biodruku
- Przenieś biotusz z żelatyną/GelMA/fibrynogenem z astrocytami do plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml za pomocą pipety 1,000 μl.
nuta: Przenoś powoli, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
- Podłączyć sterylną igłę 22 G do strzykawki.
nuta: Pozostawić strzykawkę w temperaturze 4°C na 2 minuty.
- Podłącz strzykawkę do głowicy drukującej biodrukarki i ręcznie przepłucz biotusz, aby usunąć pozostałe pęcherzyki.
- Bioprinting
UWAGA: Bioprinting został wykonany na zewnątrz okapu laminarnego.
- Umieść naczynie hodowlane o średnicy 35 mm na stole do biodrukarki i umieść igłę w odległości 0.1 mm od powierzchni szalki hodowlanej, aby umożliwić ruch igły.
UWAGA: Do każdego biodruku należy użyć jednej płytki hodowlanej o średnicy 35 mm.
- Naciśnij przycisk Drukuj.
- Po zakończeniu bioprintingu należy upewnić się, że strzykawka odsuwa się od naczynia. Następnie zamknij naczynie hodowlane i przygotuj się do procesu sieciowania.
nuta: Biodrukowanie jednego konstruktu trwa około 1 minuty i 10 sekund.
- Sieciowanie biodrukowanego konstruktu i kultury
- Umieść naczynie hodowlane w świetle UV o mocy 2 mW/cm2 przez 2 x 60 s (góra idół) w celu sieciowania GelMA.
- Pod przepływem laminarnym przenieś biodrukowany konstrukt na 24-dołkową płytkę za pomocą sterylnej szpatułki.
- Dodać 500 μl roztworu trombiny/CaCl2 i pozostawić na 30 minut, aby umożliwić sieciowanie fibryny.
- Usunąć roztwór sieciujący i przemyć konstrukt 2 ml PBS 1x. Następnie zastąpić PBS 1 ml pożywki do hodowli astrocytów i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co 3 dni.