Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Tiolacja kwasu hialuronowego
UWAGA: Proporcje molowe są podane w odniesieniu do całkowitej liczby grup karboksylowych, chyba że określono inaczej.
- Rozpuścić 500 mg hialuronianu sodu (HA, 500-750 kDa) w stężeniu 10 mg/ml w dejonizowanej wodzie destylowanej (DiH2O) w autoklawie wysterylizowanej 250 ml kolby Erlenmeyera. Mieszaj roztwór (~200 obr./min) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, aby całkowicie rozpuścić kwas hialuronowy. Użyj mieszadła i magnetycznej płytki mieszającej, aby utrzymać reakcję w ruchu podczas procedury tiolowania.
- Używając 0,1 M kwasu solnego (HCl), dostosuj pH roztworu HA do 5,5. Odważyć 69,6 mg (0,25x stosunek molowy) 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiamidu (EDC).
nuta: Chociaż nierozpuszczony EDC można dodać bezpośrednio do roztworu HA, zazwyczaj łatwiej jest najpierw rozpuścić EDC w 1 ml DiH2O, a następnie szybko dodać roztwór EDC do roztworu HA. Wstępne rozpuszczenie w 1 ml DiH2O można również przeprowadzić za pomocą N-hydroksysukcynimidu (NHS) i dihydrocholordu cystaminy przed dodaniem do reakcji w krokach 1.3 i 1.4.
- Dodać 17,9 mg (0,125x stosunek molowy) NHS do reakcji. Dostosować pH roztworu reakcyjnego do 5,5 przy użyciu 0,1 M HCl i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
- Dodać 70,0 mg (0,25x stosunek molowy) dichlorowodorku cystaminy do roztworu reakcyjnego. Użyj 0,1 M wodorotlenku sodu (NaOH), aby dostosować pH do 6,25. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez noc, mieszając.
- Następnego dnia użyj 1 M NaOH, aby dostosować pH roztworu reakcyjnego do około 8. Dodać 192 mg (4x stosunek molowy) ditiotreitolu (DTT) do reakcji. Po dodaniu DTT dostosuj pH z powrotem do 8 i pozostaw mieszając na 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Użyj 1 M HCl, aby dostosować pH do 4. Przenieść całą mieszaninę reakcyjną do wstępnie nasączonej membrany dializacyjnej (odcięcie masy cząsteczkowej około 13 kDa) i dializować z DiH2O wstępnie dostosowanym do pH 4,
nuta: Objętość DiH2O do dializy powinna być co najmniej 40 razy większa od objętości przereagowanego roztworu HA (np. 50 ml próbki w 2 L DiH2O, pH 4).
- Roztwór do dializy (DiH2O, pH 4) należy wymieniać dwa razy dziennie przez 3 dni w temperaturze pokojowej.
- Przefiltrować dializowany roztwór przez membranowy filtr próżniowy o średnicy 0,22 μm. Roztwór do błyskawicznego zamrażania tiolowanego kwasu hionowego w ciekłym azocie. Użyj liofilizatora do zamrażania suchych próbek przez 2 dni. Tiolowany kwas hialuronowy w postaci suchej może być przechowywany w zamkniętym próżniowo eksykatorze w temperaturze -20 °C przez co najmniej 6 miesięcy.
- Aby określić stopień tiolacji, użyj testu Ellmana i/lub spektroskopii protonowej NMR.
2. Przygotowanie materiałów sieciujących
- Rozpuść tiolowany kwas hiolowany w pożądanym stężeniu (w tym przykładzie 13,3 mg/ml) w soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES (20 mM HEPES w buforze soli solnej (HBSS) Hanka, dostosowanym do pH 8-9) w bursztynowej fiolce, aby zminimalizować ekspozycję na światło otoczenia. Utrzymuj roztwór w ciągłym mieszaniu.
nuta: Tworzenie wiązań dwusiarczkowych między tiolami sprzężonymi z HA może wystąpić, jeśli pH jest powyżej 8, stężenie roztworu jest zbyt wysokie lub roztwór pozostawia się w stanie mieszania zbyt długo przed żelowaniem. Aby uniknąć tego problemu, należy użyć poniżej 15 mg/ml tiolowanego kwasu hialuronowego i rozpuścić tiolowany kwas hiolowany w ciągu 2 godzin od utworzenia hydrożeli.
- Rozpuścić 4-ramienny PEG-maleimid (PEG-Mal, 20 kDa) i 4-ramienny PEG-tiol (PEG-tiol, 20 kDa) w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej (PBS), pH 7,4, w celu przygotowania 50 mg/ml roztworów podstawowych PEG-Mal i PEG-tiol.
nuta: Całkowite rozpuszczenie odczynników PEG zajmuje co najmniej 1 godzinę.
- W przypadku dodawania peptydów pochodzących z ECM, należy rozpuścić peptydy zawierające cysteinę w PBS, aby przygotować roztwór podstawowy.
nuta: Użyj stężenia zapasu 2-4 mM.
- Namocz formy z gumy silikonowej w etanolu przez co najmniej 20 minut, aby je wyczyścić, a następnie autoklaw w celu sterylizacji.
3. Sieciowanie hydrożelowe i enkapsulacja komórek
UWAGA: Jako przykład opisano tutaj enkapsulację czterech pojedynczych hydrożeli o pojemności 80 μl z 0,5% (w/v) HA i modułem ściskania 1 kPa3. Proszę zapoznać się na przykład z tabelą 1, recepturami, które dają hydrożele o różnych właściwościach: dwa hydrożele zawierające peptyd wiążący integrynę RGD i dwa hydrożele zawierające czapy cysteinowe jako negatywną kontrolę aktywności peptydów. Stężenie wysiewu komórek GBM pochodzących od pacjenta wynosi 500 000 komórek/ml.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy PEG-Mal (50 mg/ml, od kroku 2.2) do 12,5 mg/ml przez dodanie 40 μl roztworu podstawowego do 120 μl PBS. Rozcieńczony roztwór podzielić na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml każda o pojemności 80 μl.
- Dodać 16 μl podstawowego roztworu RGD (2,8 mM, z kroku 2.3) do jednej probówki i 16 μl podstawowego roztworu cysteiny (2,8 mM, z kroku 2.3) do drugiej probówki. Wirować do mieszania. Roztwory PEG-Mal-RGD lub PEG-Mal-CYS umieścić na lodzie do momentu użycia w kroku 3.9.
nuta: Opisana tutaj procedura daje hydrożele z ~140 μM peptydu. Jest to równoznaczne z tym, że około 1 na 8 dostępnych ramion PEG jest zajęte peptydem. Można to zmienić, zmieniając stosunek molowy peptydów zakończonych cysteiną do dostępnych grup maleimidowych. Ogólnie rzecz biorąc, maksymalne stężenie peptydu wynoszące 280 μM można osiągnąć przy jednoczesnym pozostawieniu wystarczającej liczby grup maleimidowych dostępnych do sieciowania hydrożelowego.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy PEG-tiol (50 mg/ml, od etapu 2.2) do 5 mg/ml przez zmieszanie 4 μl roztworu podstawowego o stężeniu 50 mg/ml z 36 μl PBS. Do mieszaniny dodać 120 μl rozpuszczonego, tiolowanego kwasu hialuronowego z etapu 2.1.
nuta: Roztwory HMW HA są bardzo lepkie. Dlatego zalecamy używanie końcówki do mikropipet o szerokim otworze do przenoszenia roztworów. Pipetę należy pipetować powoli, aby roztwór nie przywierał do ścianek końcówki mikropipety i aby poprawić dokładność pomiaru.
- Umieść czyste, suche formy (przygotowane w kroku 2.4) w każdym dołku 12-dołkowej płytki niepoddanej hodowli tkankowej. Używając czystego, końca końcówki pipety, dociśnij formę żelową i dwukrotnie sprawdź uszczelnienie między foremkami a dnem płytki dołka.
nuta: Sprawdź uszczelkę ponownie tuż przed hermetyzacją, aby zapobiec wyciekom.
- Pasaż hodowanych komórek GBM, dysocjują na pojedyncze komórki i określają stężenie komórek, jak opisano wcześniej3.
nuta: Niektóre linie GBM nie mogą być rozdzielone na pojedyncze komórki. W takim przypadku całe glejaki mogą być zamknięte. Należy jednak przygotować zdysocjowane pojedyncze komórki po precyzyjnym zliczeniu komórek, aby poprawić odtwarzalność. Protokół pasażowania glejaka różni się w zależności od różnych laboratoriów, a wiele z nich jest prawdopodobnie kompatybilnych z kapsułkowaniem hydrożelowym.
- (Zalecane) Odwirować glejaki przy 500 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i dodać 1 ml enzymu dysocjacji komórek do osadu komórkowego. Następnie inkubować przez 5 minut, delikatnie stukając w probówkę, aby zamieszać.
- Dodać 4 ml kompletnej pożywki hodowlanej (50 ng/ml EGF, 20 ng/ml FGF-2, 25 μg/ml heparyny, suplement G21 i 1% penicyliny/streptomycyny w DMEM/F12) do komórek.
- Ponownie odwirować przy 500 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki i przepuścić zawieszone komórki przez sitko o wielkości 70 μm. (Zalecane) umyć sitko dodatkowymi 4 ml kompletnego podłoża, aby zmaksymalizować liczbę odzyskanych komórek.
- Oszacuj stężenie komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru. Podziel zawiesinę komórek na 2 probówki wirówkowe, z których każda zawiera ~ 80 000 komórek. Wirować przy 500 x g przez 5 min; ogólnie rzecz biorąc, 80 000 komórek składa się z 2 80 μl hydrożeli.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić jedną osadkę w 80 μl roztworu PEG-MAL-RGD, a drugą osadkę w 80 μl roztworu PEG-MAL-CYS (przygotowanego w kroku 3.1).
- Za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl i szerokim otworze dozować 40 μl roztworu HA (z kroku 3.3 powyżej) do każdej formy z gumy silikonowej (przygotowanej w kroku 3.4).
- Za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl i szerokim otworze wymieszać 40 μl roztworu ogniw PEG-MAL-CYS lub PEG-MAL-RGD z roztworem HA w formie. Pipetuj szybko w górę i w dół, nie więcej niż 10 razy. Powtórz te czynności dla każdej przygotowywanej kultury żelowej.
nuta: Ten krok wymaga praktyki, ponieważ początkowe żelowanie następuje szybko (w ciągu 30 sekund). Pipetuj w górę i w dół, przesuwając końcówkę w różne miejsca w foremkach, aby zapewnić równomierne mieszanie. Zawsze utrzymuj końcówkę poniżej poziomu cieczy, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza. Nie mieszaj roztworu zbyt wiele razy, ponieważ może to spowodować powstanie żelu wewnątrz końcówki mikropipety. PEG-MAL-CYS i PEG-MAL-RGD można łączyć w różnych proporcjach, aby osiągnąć pożądane stężenie peptydu RGD.
- Umieścić płytkę studzienkową zawierającą komórki w kapsułkach w żelu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C na 5-10 minut, aby zapewnić zakończenie reakcji.
- Dodaj 2-2,5 ml pożywki hodowlanej do każdej studzienki z uformowanymi żelami. Użyj sterylnej końcówki do pipety o pojemności 2 μl lub mikroszpatułki, aby delikatnie oddzielić formę od żelu. Użyj wstępnie wysterylizowanych kleszczyków, aby usunąć pleśń z płytki studzienki. Umieścić płytkę studzienki z powrotem w inkubatorze komórkowym (37 °C i 5% CO2 ) w celu przeprowadzenia hodowli i przyszłych eksperymentów.
nuta: Pociągnij formę pionowo do góry, aby uniknąć uszkodzenia kultur żelowych. Ogólnie rzecz biorąc, pożywkę w kulturach żelowych należy wymieniać co 3-4 dni. Należy uważać, aby nie zasysać hydrożeli podczas usuwania podłoża. Jeśli jest to problem, zalecamy użycie plastikowej pipety transferowej. Jeśli planowane jest obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia liczby komórek, komórki GBM muszą być transdukowane lentiwirusem kodującym konstytutywną ekspresję lucyferazy przed enkapsulacją, jak opisano wcześniej3. W przypadku obrazowania bioluminescencyjnego dodaj 1 mM D-lucyferyny do pożywki hodowlanej na 1 godzinę przed obrazowaniem luminescencyjnym.
