1. Przygotowanie przed organotypowymi kulturami plastrów móżdżku
- W kapturze do hodowli komórkowej spryskanym wcześniej 70% etanolem przygotuj 200 ml pożywki hodowlanej w butelkowym filtrze próżniowym o pojemności 250 ml podłączonym do sterylnego odbiornika butelki. Dodaj 100 ml Basal Medium Eagle (BME), 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), 50 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 1 ml 200 mM L-glutaminy (końcowe stężenie 1 mM) i 5 ml 200 g/l glukozy (końcowe stężenie 5 mg/ml). Przefiltrować próżniowo pożywkę hodowlaną i utrzymywać ją w temperaturze +4 °C przez okres do miesiąca.
- W wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego wyjmij z opakowania 6-dołkową płytkę hodowlaną. Napełnij każdą studzienkę 1 ml pożywki hodowlanej. Jeśli badana jest dawka, należy dodać środek farmakologiczny do studzienki poddanej działaniu substancji i taką samą objętość roztworu nośnika do studzienki kontrolnej. W niniejszym badaniu dodaliśmy 1 μl sterylnego 3 M roztworu KCl do uzdatnionej studzienki (30 mM końcowej) i 1 μl sterylnej wody do studzienek kontrolnych.
- Wprowadzić do okapu do hodowli komórkowej potrzebną liczbę indywidualnie owiniętych wkładek do hodowli komórkowych z hydrofilową membraną z politetrafluoroetylenu (PTFE) (wielkość porów = 0,4 μm). Ostrożnie rozpakuj je i wyjmij wkładki do hodowli komórkowych za pomocą sterylnych kleszczy. Wrzuć je pojedynczo do dołka na 6-dołkowej płytce, unikając pęcherzyków na granicy faz między membraną wkładki a pożywką do hodowli komórkowej. Pozostawić wkładki w pożywce w inkubatorze o temperaturze 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny przed hodowlą.
nuta: Rozdrabniacz tkanek na stałe znajduje się w kapturze do hodowli komórkowych.
- Przygotuj dwie zlewki o pojemności 200 ml, jedną wypełnioną 150 ml sterylnej wody, a drugą wypełnioną 150 ml 70% etanolu. Zanurz narzędzia chirurgiczne w kąpieli z 70% etanolem, a następnie w wodzie przed ich użyciem.
nuta: Nie używaj narzędzi chirurgicznych bezpośrednio po kontakcie z etanolem.
- Zdezynfekuj obosieczne ostrze w zlewce z 70% etanolem. Umieść go na uchwycie ostrza za pomocą sterylnych kleszczy i przytrzymaj go na miejscu za pomocą ostrza clamp klucz. Pozostaw do wyschnięcia do czasu użycia.
- Zdezynfekuj plastikowy krążek dostarczony z rozdrabniaczem do tkanek w zlewce z 70% etanolem. Spryskaj stół do cięcia 70% etanolem przed umieszczeniem na nim tarczy. Pozostaw do wyschnięcia do czasu użycia.
2. Rozwarstwienie i organotypowe kultury warstwowe móżdżku
- Wprowadź młode myszy do kaptura do hodowli komórkowej, aby przeprowadzić sekcję.
- Szybko odetnij głowę szczeniakowi za pomocą prostych nożyczek operacyjnych (ryc. 1A).
- Trzymając głowę szczeniaka za nos za pomocą prostych kleszczy opatrunkowych, rozetnij skórę głowy prostymi nożyczkami do oczu, zaczynając od tylnego końca i idąc na boki do linii środkowej.
- Postępuj identycznie dla czaszki.
nuta: Upewnij się, że końcówki nożyczek są skierowane na zewnątrz, aby uniknąć uszkodzenia móżdżku podczas sekcji.
- Wyjmij mózg i przenieś go do 60-milimetrowego naczynia wypełnionego zimnym HBSS + 5 mg/ml glukozy.
- Ostrożnie wypreparuj móżdżek za pomocą sterylnych, prostych, cienkich kleszczy (ryc. 1B). Przenieś go na plastikowy krążek umieszczony na stole do cięcia rozdrabniacza tkanek za pomocą sterylnych, zakrzywionych drobnych kleszczyków.
- Zorientuj tkankę, obracając stół do cięcia, aby wykonać sekcje przystrzałkowe.
- Przesuń stół do cięcia, pociągając pokrętło zwalniające stół w prawo, tak aby ostrze znalazło się na krawędzi tkanki.
- Dostosuj grubość plastra do 350 μm, a prędkość ostrza na średnią.
- Uruchom helikopter. Po przecięciu całego móżdżku (ryc. 1C) wyłącz rozdrabniacz.
- Usuń plastikowy krążek za pomocą sterylnych kleszczyków.
- Ostrożnie zbliż plastikowy krążek do naczynia o średnicy 60 mm zawierającego HBSS + 5 mg/ml glukozy. Odpipetować zimny HBSS + 5 mg/ml glukozy na tkankę za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby umożliwić pobranie plastrów móżdżku w naczyniu wypełnionym buforem.
- Oddziel plastry móżdżku od siebie za pomocą mikrosondy. Wyjmij dobrej jakości skrawki za pomocą pipety transferowej (zaleca się używanie skrawków tkanek znajdujących się blisko robaka) i wrzuć je do wstępnie zbalansowanej wkładki do hodowli komórkowej (ryc. 1D).
- Umieść plastry móżdżku na wkładce do hodowli komórkowej za pomocą mikrosondy, a następnie ostrożnie usuń nadmiar roztworu glukozy HBSS + 5 mg/ml za pomocą pipety transferowej.
nuta: Na tym etapie tkanka jest niezwykle wrażliwa i podatna na uszkodzenia fizyczne. Maksymalna liczba wycinków móżdżku na wkładkę do hodowli komórkowej zależy od wieku zwierzęcia dawcy. W przypadku zwierzęcia w wieku P0–P4 można wyhodować 6–8 plastrów, a w przypadku zwierząt starszych niż P5 – 4–6 plastrów.
- Umieść naczynie hodowlane w inkubatorze, całkowicie zmieniając pożywkę co 2-3 dni.
- Aby ocenić przeżywalność komórek Purkinjego, plastry można pobrać już po 5 dniach in vitro. Do innych celów można je utrzymywać w kulturze przez kilka tygodni (ryc. 1F).
nuta: W przypadku eksperymentów z przeżywalnością komórek Purkinjego nie ma potrzeby odnawiania leczenia farmakologicznego przy zmianie pożywki do hodowli komórkowych (ryc. 1F).
3. Immunofluorescencja
- Wyjąć płytkę 6-dołkową z inkubatora. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych, umyj wkładkę do hodowli komórkowej 1x PBS i przymocuj plastry zimnym 4% roztworem paraformaldehydu przez 1 godzinę, z 1 ml pod wkładką do hodowli komórkowej i 500 μl na wierzchu wkładki do hodowli komórkowej.
- Umyj wkładki 4x 10 min za pomocą 1x PBS, z 1 ml pod spodem i 500 μl na górze wkładki, na wytrząsarce orbitalnej.
- Za pomocą pędzla przenieś plastry móżdżku z 1 wkładki do hodowli komórkowej do 1 dołka 24-dołkowego wstępnie wypełnionego 1x PBS, 0,25% Triton X-100 i 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/basenik.
- Przepuszczać i blokować plastry przez inkubację w PBS-TB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze PBS-TB, przez noc w temperaturze + 4 °C, na wytrząsarce orbitalnej, 200 μl/basenik.
- Następnego dnia wykonaj cztery płukania po 10 minut z 1x PBS, na wytrząsarce orbitalnej, 500 μL/studzienkę.
- Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze PBS-TB, przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, na wytrząsarce orbitalnej i chronić przed światłem, 200 μl/basenik.
- Wykonaj cztery płukania po 10 minut z 1x PBS, na wytrząsarce orbitalnej, 500 μL/studzienkę.
- Przeciwbarwić plastry za pomocą Hoechst 33342, rozcieńczonego w 1x PBS (2 μg/ml), przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem, 500 μl/studzienkę.
- Zamontuj plastry móżdżku na szkiełku mikroskopowym za pomocą pipety transferowej. Pozostaw je do całkowitego wyschnięcia na powietrzu, chroniąc przed światłem. Ponownie nawilż je 1x PBS i nałóż szkiełko nakrywkowe pokryte kilkoma kroplami podłoża montażowego (~80 μL). Unikaj robienia bąbelków.
- Po utwardzeniu podłoża montażowego, skrawki móżdżku są gotowe do obrazowania.
4. Obrazowanie i kwantyfikacja przeżywalności komórek
- Włącz mikroskop i lasery zgodnie z zaleceniami producenta.
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji.
- Używając obiektywu 10X, zlokalizuj niezmienione wycinki móżdżku, które mają 9–10 zrazików (zwykle odcinki móżdżku blisko robaka).
- Aktywuj akwizycję z-stack. Zdefiniuj zakres stosu z, aby objąć wszystkie komórki Purkinjego obecne w wycinku móżdżku. Ustaw rozmiar kroku 2 μm i rozpocznij akwizycję. Zapisz uzyskany obraz w formacie producenta oprogramowania do akwizycji, aby zachować skojarzone metadane.
- Otwórz uzyskany plik w ImageJ za pomocą wtyczki Bio-formats.
- Przejdź do pozycji Image > Stacks > Z-project... (Rysunek 2A).
- Wybierz opcję Max Intensity (Maksymalna intensywność) z menu rozwijanego Projection type (Typ projekcji) i kliknij przycisk OK (Rysunek 2B).
- Zostanie wygenerowany spłaszczony obraz 2-W. Kliknij dwukrotnie narzędzie Wielopunktowe, aby wyświetlić okno narzędzia Wskazywanie. Usuń zaznaczenie opcji Oznacz punkty, aby ułatwić wizualizację zliczanych komórek. Następnie kliknij bezpośrednio na somę komórki Purkinjego, aby rozpocząć liczenie (Rysunek 1E). Łączna liczba zliczonych komórek zostanie wskazana u dołu okna narzędzia Wskazywanie (Rysunek 3).
nuta: Zwykle można określić ilościowo co najmniej 3 nieuszkodzone sekcje zawierające 9–10 zrazików na wkładkę do hodowli komórkowej. Aby ocenić działanie neuroprotekcyjne środka farmakologicznego, należy przeprowadzić co najmniej 3 niezależne eksperymenty.
