Dysocjacja i hodowla neuronów z próbek tkanki hipokampa

Streszczenie

Źródło: Servello, D. et al., A Microbiomechanical System for Study Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje dysocjację i kulturę neuronów hipokampa z próbek tkanek hipokampa za pomocą dysocjacji enzymatycznych i mechanicznych. Leczenie Ara-C hamuje wzrost komórek nieneuronalnych, ułatwiając selektywny wzrost neuronów hipokampa.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Sekcja, dysocjacja i kultura neuronów hipokampa od ciężarnej myszy/szczura

1. Sekcja i dysocjacja neuronów hipokampa w celu hodowli
   1. Rozmrozić roztwór enzymazy proteazy (3 mg/ml proteazy 23 w roztworze do rozwarstwiania plastrów, SLDS, tabela 1) i wstępnie podgrzane podłoże galwaniczne (tabela 2) w temperaturze 37 °C.
   2. Wypreparuj hipokamp i spłucz SLDS.
      nuta: Cztery hipokampy zapewniają wystarczającą ilość komórek na jedną 24-dołkową lub jedną 6-dołkową płytkę.
   3. Usunąć SLDS, dodać 2 ml roztworu enzymu proteazy i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 15 minut.
   4. Umyj eksplantaty hipokampa dwukrotnie 5-10 ml podłoża galwanicznego. Dodać 5 ml podłoża galwanicznego. Dysocjuj eksplantaty hipokampa na pojedyncze komórki, generując mały wir za pomocą pipety z plastikową końcówką o pojemności 1 ml. Pipetować w górę i w dół około 40 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków tlenu, aż roztwór stanie się mętny i nie pozostaną żadne duże kawałki eksplantatu.
      nuta: Pamiętaj, aby podczas mycia zostawić trochę podłoża, eksplantaty hipokampa powinny pozostać zanurzone w pożywce przez cały proces.
   5. Odwirować komórki przy sile 1,125 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant z komórkami zanurzonymi w pożywce. Ponownie zawiesić komórki w 145 ml podłoża galwanicznego. Dodać 1 ml/dołek zawiesiny komórkowej do płytki 24-dołkowej (3 ml/basenik do płytki 6-dołkowej).
      UWAGA: 145 ml podłoża galwanicznego służy do wytworzenia zawiesiny komórek o niskiej gęstości komórek. Objętość ta pozwoli na posiew komórek na sześć płytek 24-dołkowych, osiem płytek 6-dołkowych lub różne kombinacje płytek 24- lub 6-dołkowych, w zależności od eksperymentów, które mają być przeprowadzone. Każda studzienka 24-dołkowej płytki będzie miała około 3 x 10⁴ komórek.
   6. Inkubować komórki w pożywce galwanicznej w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 2-4 godziny, a następnie usunąć wszystkie podłoża galwaniczne i zastąpić je świeżymi mediami konserwacyjnymi.
   7. Po 2 dniach (2 dni in vitro, 2DIV) zastąp połowę pożywki 2 μM Ara-C (arabinozylocytozyna) rozpuszczona w pożywce podtrzymującej, która hamuje wzrost fibroblastów, śródbłonka i komórek glejowych. Po wystawieniu komórek na działanie Ara-C przez dwa dni, zastąp pożywkę nową pożywką konserwacyjną.

Tabela 1: Roztwór do powlekania szkiełek nakrywkowych. Podaje przepis na przygotowanie roztworu do powlekania szkiełek nakrywkowych, używanego do przylegania komórek hodowlanych do szkiełek nakrywkowych.

Roztwór do powlekania szkiełek nakrywkowych
780 μL	Kwas octowy17 mM zapas: 50 μl kwasu octowego w 50 mlH2O
200 μL	Poli-D-lizyna (zapas 0,5 mg/ml)
20 μL	Kolagen z ogona szczura (zapas 3 mg/ml)
Całkowita objętość jest określana na podstawie liczby szkiełek nakrywkowych do pokrycia.

Tabela 2: Przepisy na podłoża do hodowli komórkowych. Zawiera przepisy na przygotowanie pożywki wykorzystywanej do hodowli pierwotnych komórek neuronów hipokampa.

1x Roztwór do rozwarstwiania plastrów (SLDS), przefiltrowany, pH = 7,4, przechowywać w temperaturze 4 °C
1 L	ddH2O
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
10 mM	HEPES (wolny kwas)
10 mM	D-glukoza
5 mM	MgCl2
0,00%	Czerwień fenolowa (opcjonalnie)
Media galwaniczne (PM, filtr, przechowywać w temperaturze 4 °C)
439 ml	MEM Sole Earle'a
50 ml	FBS (Sieć Usługowa
11,25 ml	20% D-glukozy
5 ml	Pirogronian sodu (100 mM,)
62,5 μL	L-glutamina (200 mM)
5 ml	Penicylina/Streptomycyna (P/S, 100x)
Media konserwacyjne (MM, filtr, przechowywać w temperaturze 4 °C)
484 ml	Neuropodstawowy
10 ml	B27 50x suplement
1,25 ml	L-glutamina (200 mM)
5 ml	100x P/S
Wszystkie roztwory są sterylizowane za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 mm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	Instrumenty Warnera	64-0702	Na płytkę 24-dołkową
Szkiełka nakrywkowe 25 mm	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-545-102	Na płytkę 6-dołkową
kwas octowy	Fisher Naukowy	A38-212
Poli-D-lizyna	Sigma	Zobacz materiał P6407
Kolagen z ogona szczura	Roche	11 179 179 001
10 razy więcej kanałów na sekundę	Diagnostyka krajowa	Zobacz materiał CL-253
Na2SO4	Fisher Naukowy	Zobacz materiał S373-500
Zobacz materiał K2SO4	Fisher Naukowy	Zobacz materiał P304-500
HEPESY	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP410-500
D-glukoza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał D16-500
MgCl2	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP214-500
NaOH	Fisher Naukowy	Zobacz materiał SS255-1
Enzym proteazy	Sigma	Zobacz materiał P4032
FBS (Sieć Usługowa	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 26140
Pirogronian sodu	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11360-070
L-glutamina	Gibco (firma Gibco)	25030081
Penicylina/Streptomycyna 100x (P/S)	Gibco (firma Gibco)	15140122
MEM Sole Earle'a	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 11090
Suplement witaminy B27	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 17504-044
Neuropodstawowy	Gibco (firma Gibco)	21103-049
Arabinozylocytozyna (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Nośniki Opti-MEM	Gibco (firma Gibco)	Nr katalogowy: 31985-070

TGL powiedział: powiedział: powiedział: