Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w oligodendrocyty

Streszczenie

Źródło: Assetta, B., et al. Generacja ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty. J. Vis. Exp (2020).

Ten film pokazuje proces generowania komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, a następnie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Ten proces generowania oligodendrocytów otwiera wiele możliwości poprawy badań i leczenia chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera.

Protokół

1. Indukcja ludzkich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z pluripotencjalnych komórek macierzystych i dojrzewanie oligodendrocytów

1. Generowanie neuronalnych komórek progenitorowych (NPC): protokół jednowarstwowy (~7 dni). Patrz rysunek 1A, aby zapoznać się ze schematem przepływu.
   1. Należy użyć dostępnych w handlu ludzkich komórek ES H1 w czasie 52 (patrz tabela materiałów). Hodować komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową pokrytych roztworem (~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową; patrz Tabela Materiałów) przy użyciu pożywki do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. Transdyferencjacja komórek w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą uznanego podejścia zwanego podwójnym SMADi, z inhibitorami małocząsteczkowymi dla wielu szlaków sygnałowych. W tym przypadku używamy powszechnie akceptowanego zestawu komercyjnego i postępujemy zgodnie z protokołem monowarstwowym dostarczonym przez producenta (patrz Tabela materiałów).
   3. W dniu -1 płytkę 0,5–1 x 10⁶ komórek na basenik na płytce 6-dołkowej pokrytej roztworem matrycy o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów; ~0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową) z pożywką do konserwacji embrionalnych komórek macierzystych (ES) (patrz Tabela materiałów). Ten roztwór matrycy o obniżonym współczynniku wzrostu służy do powlekania wszystkich płytek, które zostaną użyte w kolejnych krokach.
   4. W dniu 0 traktuj komórki przez 24 godziny pożywką podtrzymującą komórki ES (patrz Tabela materiałów) uzupełnioną 2% dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
   5. W dniach 1-6 należy wymienić całe podłoże na ciepłe (37 °C) podłoże do indukcji neuronalnej zawierające inhibitory SMAD z zestawu dostępnego w ofercie (patrz tabela materiałów). Jeśli komórki dzielą się i osiągają konfluencję przed 7 dniem, przejdź je do gęstości wysiewu 0,5–1 x 10⁶, jak opisano wcześniej w kroku 1.1.3.
   6. W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytki o gęstości wysiewu 1-2 x 10⁵ komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
   7. Skuteczność różnicowania testu za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) pod kątem braku markerów pluripotencji, takich jak OCT4, oraz obecności markerów NPC, takich jak PAX6, Nestin i Sox1.
   8. Na tym etapie oderwane NPC mogą zostać zamrożone w specjalistycznym komercyjnym medium do zamrażania NPC (patrz Tabela Materiałów) i przechowywane w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Po zamrożeniu i rozmrożeniu NPC nadal zachowują wielomoc, aby dać początek neuronom, astrocytom i OPC z niezawodnymi protokołami.
2. Wytwarzanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) (~7 dni). Patrz rysunek 1A, aby zapoznać się ze schematem przepływu.
   1. W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytka z gęstością wysiewu 1-2 x 10⁵ komórek na dołek na 24-dołkowej płytce w ciepłym (37 °C) podłożu do indukcji neuronalnej oraz inhibitory SMAD z zestawu handlowego (patrz Tabela materiałów).
   2. W dniu 8 przygotuj roztwór 1% DMSO w pożywce różnicującej OPC i traktuj posiane NPC przez 24 godziny. Pożywka różnicująca OPC składa się z: podłoża bazalnego (DMEM/F12), 1% suplementu N2, 1% suplementu B27, podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) w stężeniu 20 ng/ml, wygładzonego agonisty (SAG) w stężeniu 1 μM, płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF-AA) w stężeniu 10 ng/ml (patrz tabela materiałów).
   3. W dniu 9 zastąp media świeżymi nośnikami różnicującymi OPC bez DMSO. Karmić komórki co drugi dzień aż do 15 dnia. Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 15 dniem, przejdź je do gęstości wysiewu 1-2 x 10⁵ komórek na studzienkę, jak opisano w kroku 1.2.1.
   4. W dniu 14 umieść OPC w pożywce różnicującej OPC o gęstości 1-2 x 10⁵ komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
   5. Na tym etapie (dzień 15) należy przetestować komórki pod kątem obecności markerów specyficznych dla OPC za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) lub ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (np. O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Rysunek 1B) oraz za brak markerów NPC (Pax6 lub Nestin; Rysunek 1D). Zazwyczaj wykrywamy immunoreaktywność O4 w ponad 95% komórek w dniu 15. Szczególnie istotne dla choroby Alzheimera jest to, że ekspresja APP (białka prekursorowego amyloidu), BACE1 (proteaza przetwarzająca β-sekretaza 1) i peptyd amyloid-β (Aβ) są obfite w OPC (Figura 1F).
3. Dojrzewanie oligodendrocytów (OL) (~7–20 dni)
   1. W dniu 15 zastąp pożywkę pożywką do dojrzewania OL: pożywką Neurobaseal-A, 2% suplementem B27, 1 μM cyklicznym monofosforanem adenozyny (cAMP), 200 ng / ml trójjodotyroniny T3 i klemastyną 1 μM (patrz tabela materiałów). Zmieniaj podłoże co drugi dzień lub codziennie, jeśli to konieczne.
   2. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, podziel je w stosunku 1:3 do 2 przejść lub do momentu, gdy podział komórek znacznie spowolni. Jeśli OPC dzielą się zbyt szybko i osiągają konfluencję w czasie krótszym niż 3 dni, dodaj Ara-C (patrz Tabela Materiałów) w stężeniu 2-5 μM przez 1-3 dni. Aktywna proliferacja wskazuje na obniżoną wydajność dojrzewania.
   3. Zbadaj skuteczność dojrzewania oligodendroglialnego, oceniając ekspresję markerów OL, np. CLDN11, PLP1, MBP za pomocą qPCR, barwienia IHC lub immunoblottingu. Charakterystyczna morfologia wysoce złożonych struktur (ryc. 1C) i ekspresja markerów OL (ryc. 1E) powinny być łatwo wykryte do 28 dnia.

Wyniki

Rysunek 1: Wytwarzanie iOPC (indukowanych komórek prekursorowych oligodendrocytów) i dojrzewanie iOL (indukowanych oligodendrocytów). (A) Diagram przepływu generacji iOPC i iOL. (B) Reprezentatywne obrazy jasnego pola i immunofluorescencji iOPC w dniu 15. Olig2 (marker pan-oligodendroglia) jest pokazany na zielono, O4 (marker OPC) na czerwono, a DAPI na niebiesko. O...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dokładności	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 7920
Suplement witaminy B27	Rybak termiczny	17504044
bFGF (Fundusz Finansowy)	Rybak termiczny	PHG 0266
obóz	MiliporeSigma	A9501
Klemastyn	MiliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 średni	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 36254
Dmso	Rybak termiczny	Zobacz materiał D12345
Surowica bydlęca płodu	Komórka ScienCell	10
H1 ludzkie komórki ES	WiCell (komórka WiCell)	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 5825
Suplement N2	Rybak termiczny	17502001
Neurobazalny A średni	Rybak termiczny	Numer katalogowy 10888-022
Aminokwasy endogenne	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 11140-050
PDGF-AA	Systemy badawczo-rozwojowe	221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12251
Polibrene	MiliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12253
Inhibitor ROCK Y-27632	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 72302
Sag	Tocris powiedział:	Numer telefonu 4366
STEMdiff Neuroral Progenitor Freezing Media	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 5838
Zestaw do indukcji neuronowej STEMdiff SMADi	Technologie STEMCELL	Numer katalogowy: 8581
T3 trójjodotyronina	MiliporeSigma	Zobacz materiał T6397
Tempo-iOlogo: Ludzkie OPC pochodzące z iPSC	Tempo BioScience	Numer katalogowy: 102
TetO-NG2-Puro	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 52047
VSV-G	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 12259