$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Indukcja ludzkich neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
- Przygotowanie lentiwirusa (~5 dni)
- Płytka ~ 1 milion ludzkich embrionalnych komórek nerkowych 293T (HEK293T) w każdej kolbie T75, aby były one ~ 40% zlewające się podczas wykonywania transfekcji. Transfekować je plazmidami eksprymującymi indukowaną tetracykliną neurogeninę 2 (Ngn2) i genem opornym na puromycynę (PuroR; pod tą samą kontrolą promotora operatora Tet (TetO), odwróconym transaktywatorem tetracykliny (rtTA) i trzema plazmidami pomocniczymi pRSV-REV, pMDLg / pRRE i VSV-G (12 μg DNA wektora lentiwirusowego i 6 μg każdego z DNA plazmidu pomocniczego). Przygotować co najmniej trzy kolby na preparat lentiwirusa. Do transfekcji należy użyć polietyleniminy (PEI) zgodnie z instrukcją producenta. Wymień nośnik po 16 godzinach i wyrzuć.
- Zbierz uwolnione cząsteczki wirusa, zbierając pożywki hodowlane codziennie i zastępując je świeżymi pożywkami przez 3 dni. Zebrać zebrane pożywki zawierające cząstki wirusa do oczyszczenia. Przefiltrować wirusa przez filtr 0,22 μm i odwirować przy 49 000 x g przez 90 minut. Zawiesić osad w odpowiedniej objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)-glukozy (~150 μL).
- Indukcja neuronów (~5 dni)
nuta: Ten protokół indukcji (ryc. 1A; schemat przepływu) jest wysoce skuteczny zarówno w przypadku indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), jak i embrionalnych (ES) o potwierdzonej pluripotencji (które można oznaczyć za pomocą barwienia immunohistochemicznego dobrze scharakteryzowanych markerów pluripotencji; Rysunek 1B).
- Należy użyć dostępnych w handlu ludzkich komórek ES H1 w czasie 52 (patrz tabela materiałów). Hodować komórki na płytkach 6-dołkowych pokrytych roztworem macierzy zewnątrzkomórkowej (~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową; patrz tabela materiałów) przy użyciu pożywki do konserwacji komórek ES (patrz tabela materiałów) i inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- W dniu -2 odłączyć komórki ES (80% zlewające się) z 1 ml roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przenieść komórki do probówki; umyć studzienkę 2 ml pożywki i połączyć w tej samej probówce. Wirować przy 300 x g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w pożywce i umieścić komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą o gęstości wysiewu 1 x 105 komórek na studzienkę.
- W dniu -1 dodać lentiwirusy eksprymujące Ngn2 plus PuroR i rtTA wraz z polibrenem (8 μg/ml) do komórek ES w świeżej pożywce podtrzymującej komórki ES (patrz tabela materiałów). Dokładna liczba wirusów powinna być określona na podstawie rzeczywistych mian lub miareczkowania. Zazwyczaj dodajemy 5 μl każdego wirusa na studzienkę do płytki 6-dołkowej.
- W dniu 0 dodaj doksycyklinę (2 μg/ml, w celu aktywacji ekspresji Ngn2) w zmodyfikowanej pożywce Dulbecco Eagle / mieszaninie składników odżywczych F-12 (DMEM-F12) z suplementem N2 bez morfogenów.
- W dniu 1 dodać Puromycynę do świeżej pożywki DMEM-F12 plus N2 i doksycykliny, do końcowego stężenia 1 μg/ml pożywki. Selekcjonować transdukowane komórki w Puromycynie przez co najmniej 24 godziny. Wyższe stężenie puromycyny (do 5 μg/ml) i dłuższy okres selekcji (do 48 godzin) mogą być wymagane w celu odpowiedniego usunięcia niedostatecznie transdukowanych komórek, jeśli miano wirusa jest niskie.
- W dniu 2 odłącz różnicujące neurony roztworem do odłączania komórek (patrz Tabela materiałów) i ponownie umieść je na 24-dołkowych płytkach (między 80 000 a 200 000 komórek / dołek) pokrytych roztworem macierzy (patrz Tabela materiałów) i utrzymuj je w pożywce neurobazalnej-A (NBA) / B27 bez doksycykliny. Gęstość wysiewu ma kluczowe znaczenie.
- Na tym etapie odłączone neurony można zamrozić w specjalistycznym komercyjnym podłożu zamrażającym (patrz Tabela Materiałów) i przechowywać w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Czyste neurony można posiać, biorąc pod uwagę typową ~15%-20% śmierć komórki po rozmrożeniu, hodować samodzielnie lub współhodować z innymi typami komórek mózgowych (patrz krok 3.2.3. dla wspólnej hodowli z OPC).
- Hodowlę czystych iNs na płytkach pokrytych roztworami na bazie macierzy zewnątrzkomórkowej zgodnie z instrukcją producenta (patrz tabela materiałów). Charakterystyczna morfologia piramidalna powinna być widoczna w 4 dniu (i 6 dniu; Rysunek 1C). Tworzenie synaps można wykryć już w dniach od 14 do 16 i jest widoczne w dniu 24 za pomocą barwienia immunohistochemicznego standardowymi markerami pre- i postsynaptycznymi. (Figura 1D; znakowana markerem presynaptycznym Synapsyna 1 i markerem dendrytycznym Map2).
2. Indukcja ludzkich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) z pluripotencjalnych komórek macierzystych i dojrzewanie oligodendrocytów
- Generowanie neuronalnych komórek progenitorowych (NPC): protokół jednowarstwowy (~7 dni). Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się ze schematem bloku.
- Hoduj ludzkie komórki ES H1, jak opisano wcześniej (patrz krok 1.2.1.) i zróżnicuj je w neuronalne komórki progenitorowe (NPC) za pomocą ustalonego podejścia zwanego podwójnym SMADi, z małocząsteczkowymi inhibitorami dla wielu szlaków sygnałowych. W tym przypadku używamy powszechnie akceptowanego zestawu komercyjnego i postępujemy zgodnie z protokołem monowarstwowym dostarczonym przez producenta (patrz Tabela materiałów).
- W dniu -1 płytka 0,5–1 x 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej pokrytej roztworem matrycy o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów; ~ 0,5 mg roztworu matrycy na płytkę 6-dołkową) z pożywką do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów). Ten roztwór matrycy o zredukowanym czynniku wzrostu służy do pokrycia wszystkich płytek, które zostaną użyte w kolejnych krokach.
- W dniu 0 traktuj komórki przez 24 godziny pożywką do konserwacji komórek ES (patrz Tabela materiałów) uzupełnioną 2% DMSO.
- W dniach 1-6 należy wymienić całe podłoże na ciepłe (37 °C) podłoże do indukcji neuronalnej zawierające inhibitory SMAD z zestawu dostępnego w sprzedaży (patrz Tabela materiałów). Jeśli komórki dzielą się i osiągają konfluencję przed 7 dniem, przejdź je do gęstości wysiewu 0,5–1 x 106, jak opisano wcześniej w kroku 2.1.2.
- W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytki o gęstości wysiewu 1-2 x 105 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
- Oznacz skuteczność różnicowania za pomocą barwienia immunohistochemicznego (IHC) pod kątem braku markera pluripotencji, na przykład czynnika transkrypcyjnego wiążącego oktamer 4 (OCT4) oraz obecności markerów NPC, takich jak sparowane pole 6 (PAX6), Nestyna i region determinujący płeć czynnik transkrypcyjny Y-box 1 (Sox1).
- Na tym etapie oderwane NPC mogą zostać zamrożone w specjalistycznym komercyjnym medium do zamrażania NPC (patrz Tabela Materiałów) i przechowywane w ciekłym azocie przez okres do 3 miesięcy. Po zamrożeniu i rozmrożeniu NPC nadal zachowują wielomoc, aby dać początek neuronom, astrocytom i OPC z niezawodnymi protokołami.
- Wytwarzanie komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) (~7 dni). Patrz rysunek 2A, aby zapoznać się ze schematem przepływu.
- W dniu 7 pasaż NPC za pomocą roztworu do oddzielania komórek (patrz Tabela materiałów) i płytka z gęstością wysiewu 1-2 x 105 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce w ciepłym (37 °C) podłożu do indukcji neuronalnej oraz inhibitory SMAD z zestawu handlowego (patrz Tabela materiałów).
- W dniu 8 przygotuj roztwór 1% dimetylosulfotlenku (DMSO) w pożywce różnicującej OPC i traktuj posiane NPC przez 24 godziny. Pożywka różnicująca OPC składa się z: pożywki DMEM/F12, 1% suplementu N2, 1% suplementu B27, podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) w stężeniu 20 ng/ml, wygładzonego agonisty (SAG) w stężeniu 1 μM, płytkowego czynnika wzrostu AA (PDGF-AA) w stężeniu 10 ng/ml (patrz tabela materiałów).
- W dniu 9 zastąp media świeżymi nośnikami różnicującymi OPC bez DMSO. Karmić komórki co drugi dzień aż do 15 dnia. Jeśli komórki osiągną konfluencję przed 15 dniem, należy je przepchnąć do gęstości wysiewu 1–2 x 105 komórek na studzienkę, jak opisano w kroku 2.2.1.
- W dniu 14 umieść OPC w pożywce różnicującej OPC o gęstości 1-2 x 105 komórek/dołek na 24-dołkowej płytce.
- Na tym etapie (dzień 15) należy przetestować komórki pod kątem obecności markerów specyficznych dla OPC za pomocą barwienia IHC lub qPCR (np. O4, czynnik transkrypcyjny linii oligodendrocytów [Olig]-1/2, siarczan chondroityny proteoglycan 4 / antygen glejowy neuronu 2 [CSPG4 / Ng2 [, NK2 Homeobox 2 [NKX2.2], receptor alfa płytkowego czynnika wzrostu [PDGFRa]; Rysunek 2B) oraz za brak markerów NPC (Pax6 lub Nestin; Rysunek 2D). Zazwyczaj wykrywamy immunoreaktywność O4 w ponad 95% komórek w dniu 15. Szczególnie istotna dla choroby Alzheimera jest ekspresja APP (białka prekursorowego amyloidu), BACE1 (proteazy przetwarzającej β-sekreatazy 1) i peptydu amyloidu-β (Aβ) jest obfita w OPC (Figura 2F).
3. Hodowla ludzkich neuronów indukowanych (iNs) i komórek prekursorowych oligodendrocytów (iOPC)
- Poszycie iOPC (~3 dni)
- Płytka iOPC w dniu 14 o gęstości 1 x 10 5 komórek na basenik w płytce 24-dołkowej (jak opisano powyżej w kroku 2.2.4.) w pożywce różnicującej OPC (jak opisano w kroku 2.2.2.).
- Ustanowienie wspólnej kultury iN-iOPC
- W dniu 15 odłącz indukowane neurony ludzkie na etapie dnia 2 po selekcji Puromycyny (jak opisano w kroku 1.2.6.) roztworem do odłączania komórek (patrz tabela materiałów).
- Dodaj neurony do hodowanych OPC, posiewając z gęstością wysiewu 2 x 105 komórek na dołek na 24-dołkowej płytce z rosnącymi OPC (od kroku 3.1.1). Użyj pożywki do kohodowli zawierającej pożywkę Neurobasal-A, 2% suplement B27 i 100 ng/ml trójjodotyroniny T3. Zmień podłoże następnego dnia, a następnie co drugi dzień. Jeśli OPC namnażają się zbyt szybko i osiągają zbieg w czasie krótszym niż 3 dni, dodaj arabinozyd cytozyny (Ara-C) w stężeniu 2–5 μM. Reprezentatywny obraz neuronów iN i iOPC wyhodowanych w kokulturze po 7 dniach przedstawiono na rycinie 3A.
- Użyj zamrożonych neuronów przygotowanych w sposób opisany powyżej w kroku 1.2.7 do jednoczesnej hodowli z OPC. Płytki zamrażają i rozmrażają neurony o większej gęstości 3 x 105 komórek na dołek.
- Po dniu 14-16 w kokulturach tworzenie synaps w iNs można zaobserwować poprzez barwienie IHC markerów pre- i postsynaptycznych, a do 21 dnia punkta synaptyczna powinna być obfita (ryc. 3C), a aktywność neuronów można wiarygodnie zarejestrować.
- Począwszy od 21 dnia, testuj komórki pod kątem markerów specyficznych dla OL (na przykład podstawowego białka mieliny [MBP] i białka proteolipidowego 1 [PLP1]). Do 28 dnia zwykle obserwujemy zjawisko otaczania aksonów iN przez procesy iOL, znakowane barwieniem IHC dla określonych markerów (Figura 3B; neurofilament [NF] dla aksonów iN i MBP dla procesów iOPC).
