Strategie transplantacji komórek macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez radioterapię czaszki

Podsumowanie

Pacjenci z guzami mózgu rutynowo poddawani są radioterapii czaszki, a choć metoda ta jest korzystna, często prowadzi do wyniszczających zaburzeń poznawczych. Ten poważny, nierozwiązany problem nie ma obecnie żadnego klinicznego lekarstwa, co skłoniło nas do podjęcia wysiłków w celu opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych w celu przywrócenia funkcji poznawczych upośledzonych przez promieniowanie.

Streszczenie

Radioterapia często stanowi jedyne rozwiązanie kliniczne dla osób cierpiących na pierwotne lub przerzutne guzy mózgu. Mimo swoich zalet, napromieniowanie czaszki może wywołać postępujący i wyniszczający spadek funkcji poznawczych, który może być częściowo spowodowany wyczerpaniem zasobów neuralnych komórek macierzystych. Biorąc pod uwagę zwiększoną przeżywalność pacjentów z diagnozą raka mózgu, jakość życia w zakresie zdrowia poznawczego stała się coraz większą kwestią nurtującą lekarzy, szczególnie w obliczu braku satysfakcjonujących metod leczenia długoterminowego.

Aby rozwiązać ten poważny problem zdrowotny, zastosowaliśmy zastępowanie komórek macierzystymi jako strategię walki z indukowanym promieniowaniem pogorszeniem funkcji poznawczych. W naszym modelu wykorzystano szczury naga atymiczne poddane napromieniowaniu czaszki. Promieniowanie jonizujące jest dostarczane w formie napromieniowania całego mózgu lub jako silnie skupiona wiązka skierowana do hipokampa poprzez linucho astereotaktyczna radiochirurgia z wykorzystaniem akceleratora liniowego (LINAC). Dwa dni po napromieniowaniu do hipokampa stereotaktycznie przeszczepiono ludzkie neurony macierzyste (hNSCs). Następnie, 1 i 4 miesiące po napromieniowaniu, oceniano u szczurów zmiany w funkcjach poznawczych, przeżywalność przeszczepionych komórek oraz ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania. Nasze paradygmaty testów poznawczych wykazały, że zwierzęta z przeszczepionymi hNSCs wykazują znaczną poprawę funkcji poznawczych. Nieobciążona stereologia ujawniła znaczną przeżywalność (10-40%) przeszczepionych komórek w 1. i 4. miesiącu po transplantacji, w zależności od ilości i rodzaju przeszczepionych komórek. Przeszczepione komórki migrują w szerokim zakresie, różnicują się w kierunku linii glejowych i neuronalnych oraz wykazują ekspresję szeregu niedojrzałych i dojrzałych markerów fenotypowych.

Nasze dane wykazują bezpośrednie korzyści poznawcze wynikające z przeszczepienia ludzkich komórek macierzystych, co sugeruje, że procedura ta może w przyszłości stanowić obiecującą strategię długoterminowej funkcjonalnej regeneracji funkcji poznawczych u osób poddanych radioterapii czaszki. Aby ułatwić rozpowszechnianie kluczowych procedur niezbędnych do powtórzenia i rozszerzenia naszych badań, przygotowaliśmy pisemną i wizualną dokumentację kilku kluczowych etapów naszego planu doświadczalnego, ze szczególnym uwzględnieniem stereotaktycznej radiocyrurgii oraz transplantacji.

Protokół

Nasz plan eksperymentalny przedstawiono schematycznie na Rysunku 1.

1. Hodowla i przygotowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych (NSCs) do transplantacji

1. W badaniu tym zastosowano linię komórkową EnStem-A (EMD Millipore). NSCs są rutynowo walidowane przez producenta pod kątem wysokiego poziomu ekspresji markerów multipotencjalnych nestyny i Sox2 oraz niskiego poziomu ekspresji markera pluripotencjalnego Oct-4, wraz ze zdolnością do różnicowania się w wiele fenotypów neuronalnych i utrzymania prawidłowego kariotypu po wielu pasażach. W naszych warunkach hodowli NSCs te wykazywały obfitą ekspresję Sox2 i nestyny oraz zachowały zdolność do różnicowania, jak opisano wcześniej¹. NSCs hodowano w kolbach do hodowli tkankowej pokrytych poli-L-ornityną (20 μg/ml) i lamininą (5 μg/ml). Komórki hodowano w pożywce do ekspansji neuronalnej (Millipore) uzupełnionej o L-glutaminę (2 mM) i podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF; 20 ng/ml). Adherentne monowarstwy NSCs pasażowano co drugi dzień (1:2), stosując accutase jako środek dysocjujący¹. Do badań nad transplantacją wykorzystywano NSCs o numerze pasażu poniżej 10.
2. NSCs znakowano 5-bromo-2'-deoksyurydyną (BrdU) poprzez uzupełnienie pożywek wzrostowych o 4 μM BrdU na trzy dni przed transplantacją. Aby zweryfikować indeks znakowania BrdU (t.j. procent komórek dodatnich pod kątem BrdU), komórki wysiano na szkiełka komorowe i poddano detekcji BrdU z zastosowaniem standardowych metod immunocytochemicznych. Komórki wykorzystywane do transplantacji rutynowo wykazują indeksy znakowania przekraczające 90%². Alternatywnie, przeszczepione ludzkie komórki macierzyste wykrywano za pomocą specyficznego dla ludzi markera antygenu jądrowego (HuNu)².
3. W dniu transplantacji accutase oraz pożywki do ekspansji neuronalnej podgrzano wstępnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C. Komórki umieszczono w pożywce inkubacyjnej (pożywka do ekspansji neuronalnej zawierająca 10 μM Y-27632) na jedną godzinę. Y-27632 (inhibitor ROCK, EMD-Calbiochem) zastosowano w celu poprawy przeżywalności NSCs po transplantacji.
4. Po godzinie usunięto pożywkę inkubacyjną i potraktowano komórki preparatem accutase przez 5 minut. Po tej krótkiej obróbce dodano taką samą objętość pożywki do ekspansji neuronalnej, aby zneutralizować accutase, a następnie przefiltrowano komórki przez sito komórkowe 70 μM.
5. Należy policzyć komórki za pomocą hematocytometru i przygotować zawiesinę 1,0 x 10⁵ żywych NSCs na mikrolitr w pożywce do iniekcji (pożywka do ekspansji neuronalnej zawierająca 10 μM Y-27632, 40 ng/ml bFGF, 20 ng/ml BDNF).
6. Komórki przechowywano w pożywce do ekspansji neuronalnej (jak opisano w 1.5) w lodzie do czasu transplantacji; należy ich użyć w ciągu 6h, aby zminimalizować śmierć komórek spowodowaną przedłużonym przechowywaniem w niskiej temperaturze.

2. Radioterapia – planowanie leczenia i napromieniwanie

1. Uśpione szczury naga beztymusowe umieszczono w laboratoryjnym skanerze MRI w pozycji brzusznej z czaszką w części górnej (pierwszym wchodzi głowa). Ten skaner 3 tesla jest przeznaczony do badań małych zwierząt. Zapewnia on doskonały kontrast tkanek miękkich przy wysokiej rozdzielczości przestrzennej obrazów przekroju poprzecznego (osiowych). Skanowanie skoncentrowano na obszarze czaszki i wygenerowano zestaw 22 obrazów ważonych T2 E60 o grubości 0,8 mm. Obrazy te dostarczają niezbędnych informacji do zidentyfikowania lewego i prawego hipokampa w mózgu szczura.
2. Po skanowaniu MRI (24 h) zwierzęta uśpiono [koktajl anestetyczny (ketamina 30 mg/kg, ksylazyna 2,5 mg/kg i acepromazyna 1 mg/kg)] i umieszczono w onkologicznym skanerze CT, gdzie wygenerowano kolejny wolumen obrazów przekroju poprzecznego (osiowych). Szczura umieszczono w tej samej lub zbliżonej pozycji, co podczas skanowania MRI, a urządzenie CT ustawiono na skanowanie obszaru czaszki. Wygenerowano badanie składające się ze 106 obrazów CT o grubości 0,8 mm, które stały się danymi do planowania leczenia CT.
3. Planowanie leczenia
   1. Dane obrazowe MRI i CT przekazano do oprogramowania do planowania leczenia ECLIPSE (Varian Medical Systems, Palo Alto, CA) za pomocą standardu DICOM (Digital-Imaging and Communications in Medicine). ECLIPSE to zaawansowane, komercyjnie dostępne oprogramowanie stosowane w onkologii radioterapeutycznej do modelowania i projektowania optymalnego planu naświetlania pacjenta. Uwzględnia ono informacje o gęstości organów wyodrębnione z danych obrazowych CT i wykorzystuje je do obliczenia rozkładu dawki promieniowania w organizmie.
   2. Przykryj zwierzę małym polem operacyjnym, pozostawiając odsłoniętą tylko głowę. Stabilnie zamocuj głowę zwierzęcia w ramiączku stereotaktycznym (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), wprowadzając pręty uszne do zewnętrznego przewodu słuchowego. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wsuwania końcówki pręta usznego do przewodu słuchowego. Umieść pręt siekaczy, zahaczając o górne siekacze szczura i dostosowując wysokość pręta do standardowego punktu odniesienia, a następnie dokręć zacisk nosowy.
   3. Wycentruj pozycję głowy pomiędzy prętami usznymi przy minimalnym ruchu bocznym (± 4 mm), aby osiągnąć zero stereotaktyczne.
   4. Kolejnym krokiem w procesie jest określenie techniki napromieniowania. Radioterapia modulowana intensywnością (IMRT) oraz wolumetrycznie modulowana terapia łukowa (VMAT) w formie RapidArc to dwie wysokoprecyzyjne techniki napromieniowania, które wykorzystują wiązkę fotonową 6 MV do dostarczenia dawki promieniowania^3-6. Różnica między tymi technikami polega na tym, że IMRT dostarcza dawkę za pomocą kilku statycznych trajektorii, z których każda odpowiada innemu kierunkowi, ale zbiegają się one w objętości docelowej, co jest bardziej odpowiednie dla ekstremalnie małych objętości celu. Z kolei RapidArc dostarcza dawkę dynamicznie poprzez jeden lub więcej łuków skoncentrowanych na obszarze docelowym (Rys. 4).
   5. Niezależnie od techniki dostarczenia, informacje o dawce docelowej, konformalności celu i ograniczeniach dawki dla organów krytycznych muszą zostać wprowadzone w oknie optymalizacji dawki w programie ECLIPSE. Informacje te, wraz z objętościami organów, są wykorzystywane do dopasowania rozkładu dawki, co osiąga się poprzez ciągłą zmianę tłumienia wiązki podczas napromieniowania.
   6. Po wygenerowaniu planu program ECLIPSE przedstawia obliczoną dawkę nałożoną na obrazy osiowe, czołowe i strzałkowe (Rys. 5) oraz w formacie histogramu dawka-objętość (DVH) (Rys. 6>). W tym momencie plan musi zostać oceniony, aby stwierdzić, czy nadaje się do realizacji, czy wymaga poprawy.
4. Proces napromieniowania
   1. Po zatwierdzeniu planu do realizacji, z danych planowania leczenia CT w programie ECLIPSE wygenerowano obrazy cyfrowo rekonstruowanych radiogramów (DRR). Są to obrazy ortogonalne ważone gęstością kości, aby wyróżnić czaszkę i inne kostne punkty orientacyjne. Następnie plan leczenia i obrazy DRR są przesyłane do komputerowego systemu realizacji leczenia za pomocą standardu DICOM.
   2. System realizacji steruje akceleratorem liniowym Varian Trilogy, zazwyczaj stosowanym w radioterapii ludzi. Akcelerator jest wyposażony w 120 sterowanych komputerowo cienkich kolimatorów wielkolistkowych (MLC) oraz system obrazowania rentgenowskiego o jakości diagnostycznej w ramach systemu obrazowania pokładowego (OBI). System ten przesyła specyficzne informacje z programu ECLIPSE i rekonfiguruje parametry kolimatora w akceleratorze w celu dostarczenia zaplanowanej dawki.
   3. W tym momencie szczura przygotowano do napromieniowania: uśpiono go i przykryto papierowym kocem, aby utrzymać ciepłotę ciała. Po kilku minutach szczura wraz z kocem, ale z odsłoniętą czaszką, umieszczono na stole zabiegowym w tej samej pozycji, która była stosowana do wykonania skanu CT. Jest to krytyczny krok, ponieważ dokładność ułożenia jest bezpośrednio skorelowana z dokładnością dostarczenia dawki.
   4. Gdy szczur został prawidłowo umieszczony na stole zabiegowym, wykonano zestaw ortogonalnych obrazów rentgenowskich za pomocą systemu OBI akceleratora Trilogy. Są to obrazy o wysokiej rozdzielczości, które następnie zostały zfuzowane z obrazami DRR wygenerowanymi przez program ECLIPSE przy użyciu oprogramowania do fuzji obrazów OBI.
   5. Obrazy rentgenowskie i DRR zostały dopasowane cyfrowo za pomocą oprogramowania, które dostarcza informacji o przesunięciach pozycji stołu, jakie należy wykonać, aby osiągnąć ko-rejestrację obrazów (Rys. 7>). Po przeanalizowaniu tych informacji i zweryfikowaniu, że wynikające z nich przesunięcia nie doprowadzą przypadkowo do kolizji między akceleratorem a stołem zabiegowym, komputer stosuje przesunięcia, a stół zabiegowy automatycznie przesuwa się do pożądanej pozycji.
   6. W tym momencie rozpoczyna się napromieniowanie. Aby dostarczyć dawkę 10 Gy przy użyciu planu IMRT z 6 polami, czas włączenia wiązki wynosi około 10 minut, podczas gdy dwa łuki RapidArc zajmują ok. 3 minut. Po zakończeniu realizacji leczenia szczura usunięto z sali zabiegowej i pozostawiono do wybudzenia w klatce holdingowej umieszczonej na podkładce grzewczej.

3. Operacja stereotaktyczna w celu transplantacji ludzkich komórek macierzystych do hipokampa

1. Utrzymanie zwierząt i przygotowanie chirurgiczne
   1. W niniejszym badaniu wykorzystano dwumiesięczne szczury ATN pozyskane z National Cancer Institute (szczep 0N01 Cr:NIH-rnu). Zwierzęta utrzymywano w sterylnych klatkach w środowisku barierowym A z kontrolowaną temperaturą i oświetleniem, w cyklu światło/ciemność 12 h/12 h. Szczury otrzymywały autoklawowaną karmę i wodę ad libitum; w celu zapobiegania infekcjom oczu raz w tygodniu oczyszczano je maścią okulistyczną Vetropolycin (Western Medical Supply, Arcadia, CA).
   2. Przed zabiegiem stereotaktycznym szczury znieczulono poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo (i.p.) koktajlu anestetycznego (ketamina, 30 mg/kg, ksylazyna, 2,5 mg/kg i acepromazyna, 1 mg/kg). Pełne znieczulenie nastąpiło po 10–15 minutach, a stopień sedacji monitorowano za pomocą odruchu dotykowego (uciśnięcie palca u nogi). Jeśli było to konieczne w trakcie operacji, w celu utrzymania odpowiedniego poziomu znieczulenia podawano 15–20% pierwotnej dawki.
   3. Usunąć sierść z głowy za pomocą strzygarki elektrycznej. Należy ogolić obszar stanowiący około 200% miejsca operowanego, aby zapobiec infekcjom przenoszonym przez włosy. Przed wykonaniem nacięcia oczyścić ogoloną część za pomocą powidonu z jodem (3 razy), a następnie 70% alkoholu (3 razy).
2. Zabieg stereotaktyczny
   1. Instrumenty stereotaktyczne (monitor cyfrowy i rama), wiertarka mikromotoryczna, sterylizator do suchego podłoża oraz kontrolery powinny znajdować się w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec możliwej infekcji podczas procedury chirurgicznej u szczurów ATN. Do utrzymania ciepłoty ciała zwierząt podczas operacji można zastosować stół stereotaktyczny z wbudowaną matą grzewczą. Przez cały czas trwania zabiegu stosowano sterylne rękawiczki nitrylowe „Kimberly-Clark Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves”. Rękawice te są pakowane indywidualnie w sterylne worki (Kat. nr 55093). Dodatkowo chirurg stosował spray z 70% alkoholu do sterylizacji dłoni w trakcie operacji.
   2. Przykryć zwierzę małym obłożeniem chirurgicznym, pozostawiając odsłoniętą jedynie głowę. Głowę zwierzęcia należy mocno unieruchomić w ramie stereotaktycznej (Benchmark Digital, Leica-myNeurolab), wprowadzając pręty uszne do zewnętrznego przewodu słuchowego. Należy zachować szczególną ostrożność podczas wsuwania końcówki pręta usznego do kanału słuchowego. Zamocować pręt do siekaczy, zahaczając o górne siekacze szczura i dostosowując wysokość pręta do standardowego punktu odniesienia, a następnie dokręcić zacisk nosowy.
   3. Wycentrować pozycję głowy pomiędzy prętami usznymi przy minimalnym ruchu bocznym (± 4 mm), aby osiągnąć zero stereotaktyczne.
   4. Po wykonaniu kroków pozycjonowania nałożyć nawilżającą maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu i chronić przed możliwym zachlapaniem jodem lub alkoholem. Maści należy używać co najmniej 2 razy w trakcie operacji.
   5. Za pomocą sterylnego skalpela wykonać nacięcie skóry w linii środkowej (2 cm) wzdłuż skóry głowy, a następnie oczyścić obszar sterylnym aplikatorem z bawełnianą końcówką. Unikać uszkadzania obszarów mięśni ogonowych i szyjnych.
   6. Za pomocą retraktora do dyssekcji odsunąć okostną i oczyścić tkankę miękką aplikatorem z bawełnianą końcówką nasączonym 1% nadtlenkiem wodoru (w PBS). Aby zatamować krwawienie, należy utrzymywać silny ucisk przez co najmniej 1 min za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką lub gazy. Do oczyszczenia czaszki stosować energiczne ruchy skrobiące, a w przypadku skóry ruchy przykładające, aż do momentu uwidocznienia szwów czaszkowych, bregmy i lambdy.
   7. Precyzyjne współrzędne stereotaktyczne, odniesione do bregmy, określono na podstawie atlasu mózgu szczura⁷. Transplantację komórek macierzystych wykonano w czterech różnych miejscach w każdej półkuli, stosując następujące współrzędne stereotaktyczne:
      1. przednio-tylne (AP) 3,0 mm od bregmy, przyśrodkowo-boczne (ML) 1,8 mm od linii środkowej oraz grzbietowo-brzuszne (DV) 3,2 mm od powierzchni mózgu.
      2. AP: 3,6 mm; ML: 2,5 mm; DV: 3,2 mm
      3. AP: 4,2 mm; ML: 3,2 mm; DV: 3,2 mm
      4. AP: 4,2 mm; ML: 3,2 mm; DV: 3,2 mm
   8. Po zidentyfikowaniu bregmy wszystkie trzy współrzędne (AP, ML i DV) należy wyzerować na wyświetlaczu/kontrolerze cyfrowym (w cyfrowej ramie stereotaktycznej). Następnie należy zaznaczyć precyzyjne miejsca transplantacji (korzystając z powyższych współrzędnych) za pomocą cienkopisu przymocowanego do małego uchwytu sondy na ramie.
   9. Wywiercić otwór o średnicy 0,35 mm (wiertło dentystyczne nr 1/4, wiertła z węglika wanadu) w czaszce za pomocą wiertarki mikromotorycznej sterowanej pedałem nożnym (Leica-myNeurolab). Należy uważać, aby nie uszkodzić opony twardej. Jeśli podczas wiercenia wystąpi krwawienie, zastosować silny ucisk aplikatorem z bawełnianą końcówką. Nie stosować alkoholu ani jodu w miejscu wiercenia, ponieważ może to spowodować podrażnienie u zwierzęcia.
   10. Szczury otrzymały obustronne wstrzyknięcia dohipokampalne zawiesiny NSCs w maksymalnej objętości 1 μL za pomocą mikrosyringi Hamiltona 5 μL (igła 30 G). Dokładna liczba komórek w tej objętości będzie różnić się w zależności od specyfiki eksperymentu. W tym celu mikrosyringę przymocowano do małego uchwytu sondy w ramie stereotaktycznej. Ostrożnie wprowadzić końcówkę igły przez czaszkę aż do osiągnięcia powierzchni mózgu (tzn. opon mózgowych). W tym momencie współrzędną DV należy wyzerować na wyświetlaczu/kontrolerze cyfrowym, a następnie delikatnie wprowadzić igłę na pożądaną głębokość (DV: 3,2 mm). Odczekać 1 min przed rozpoczęciem wstrzykiwania komórek.
   11. Wstrzykiwać z prędkością 0,25 μL/min (powolne uwalnianie), korzystając z timera. Po wstrzyknięciu łącznie 1 μL odczekać 8 min przed wycofaniem igły z miejsca transplantacji. Po tym czasie powoli wycofać igłę z miejsca transplantacji (0,5 mm/min), aby zapobiec cofaniu się treści wstrzykiwanej przez kanał igły (refluks kapilarny).
   12. Powtórzyć kroki 3.2(j-k) dla pozostałych miejsc transplantacji (4 na półkulę).
   13. Usunąć retraktor skóry z czaszki i za pomocą tępych pęset delikatnie odsunąć odsuniętą skórę, a następnie założyć 4–5 sterylnych klipsów ze stali nierdzewnej za pomocą aplikatora do szwów chirurgicznych Autoclips (Leica-myNeurolab).
   14. Po zdjęciu zwierzęcia z ramy wstrzyknąć lek przeciwbólowy (Buprenorfina, 0,1 mg/kg, s.c., co 12 h) oraz roztwór Ringera z mleczanem (5 mL/250 g dorosłego szczura, s.c.).
   15. Umieścić zwierzę z powrotem w klatce, która powinna znajdować się na macie grzewczej. Monitorować zwierzę do momentu odzyskania przytomności przed przeniesieniem do pomieszczenia chlewni. W każdej klatce umieścić namoczone granulki karmy oraz transgel w oddzielnej szalce Petriego. Alternatywnie jako źródło wody i składników odżywczych można zastosować DietGel Recovery (ClearH₂O, Portland, ME).
   16. Monitorować zwierzęta podczas rekonwalescencji i podawać leki przeciwbólowe (buprenorfina 0,02 mg/kg (co 12 h przez 2 dni). Sprawdzać pod kątem objawów bólu, stresu, zaczerwienienia lub infekcji w miejscu operacji. Raz dziennie (przez 2–3 dni) stosować powidon z jodem lub maść neomycynową, aby zapobiec ewentualnej infekcji. Jeśli jakiekolwiek objawy infekcji, bólu lub stresu utrzymują się po zastosowaniu leków przeciwbólowych lub antybiotykoterapii w ciągu 12 godzin od operacji, należy skonsultować się z lekarzem weterynarii lub personelem opieki nad zwierzętami w celu uzyskania dalszej pomocy.

4. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schematyczny przedstawienie naszego planu eksperymentalnego.

Rysunek 2. Fuzja obrazów TK (anatomia kostna) i MRI (tkanki miękkie) w oprogramowaniu ECLIPSE. Dopasowanie przekrojów osiowych, czołowych i strzałkowych umożliwia korejestrację krytycznych cech anatomicznych mózgu szczura uzyskanych z każdej z metod obrazowania.

Rysunek 3. Wyznaczone obszary hipokampów w mózgu. Po fuzji obrazów zidentyfikowano i obrysowano w przekroju osiowym hipokampy oraz pozostałą część mózgu, definiując konkretne regiony wolumetryczne dla tych organów. Regiony te dostarczają informacji anatomicznych i objętościowych niezbędnych do dostosowania rozkładu dawki do pożądanego celu lub celów.

Rysunek 4. Opcje naświetlania o wysokiej precyzji z wykorzystaniem radioterapii z modulacją intensywności (IMRT) lub wolumetrycznie modulowanej terapii łukowej (VMAT) w formie RapidArc. Techniki te dostarczają wiązki fotonów 6 MV albo jako wiele statycznych trajektorii, które mogą zbiegać się na bardzo małych objętościach celu (IMRT), albo dynamicznie jako jeden lub więcej łuków skupionych na obszarze celu (RapidArc).

Rycina 5. Dawki obliczone w systemie ECLIPSE nałożone na obrazy osiowe. Przedstawione dawki dotyczą planów leczenia napromieniowaniem pojedynczego lub obydwu hipokampów.

Rysunek 6. Obliczony przez system ECLIPSE histogram dawka-objętość. Dane przedstawiają kontrast procentowej objętości hipokampa napromieniowanego w stosunku do nienapromieniowanego zgodnie z pojedynczym planem leczenia hipokampa przedstawionym na rys. 5.

Rysunek 7. Pozycjonowanie szczura pod kontrolą obrazowania w radioterapii. Ortogonalne obrazy cyfrowo rekonstruowanego radiogramu (DRR), wygenerowane z danych planowania leczenia CT w programie ECLIPSE, są łączone z ortogonalnymi obrazami RTG szczura na stole zabiegowym, wykonanymi za pomocą wbudowanego systemu obrazowania (OBI) urządzenia Trilogy. Obrazy DRR są ważone według gęstości kości, co uwydatnia czaszkę i inne punkty kostne ułatwiające korejestrację z obrazami OBI. Dopasowanie tych zestawów pozwala wyznaczyć przesunięcia pozycji stołu zabiegowego, które należy wprowadzić w celu osiągnięcia korejestracji obrazów CT i RTG.

Rysunek 8. Lokalizacja przeszczepionych NSCs po zabiegu stereotaksycznym. Miesiąc po transplantacji zwierzęta poddano perfuzji, a mózgi pocięto i zabarwiono BrdU (w celu wykrycia przeszczepionych NSCs) oraz zabarwiono kontrastowo hematoksyliną. Tor igły (Nt, czerwona linia) wskazuje trajektorię wstrzyknięcia, która doprowadziła do osadzenia NSCs w miejscu uwalniania przeszczepu (Tr), tuż poniżej ciała modzelowatego (CC) i powyżej obszaru CA1. Przeszczepione NSCs wykazały rozległą migrację z Tr przez cały hipokamp biorcy (zakręt zębaty, DG; hilus zakrętu zębatego, DH; podpola CA1 i CA3; powiększenie x4). Pasek skali, 200 μm.

Dyskusja

Prowadzonych jest wiele badań nad wieloma sposobami klinicznego wykorzystania komórek macierzystych w celu przywrócenia prawidłowych funkcji uszkodzonym, starzejącym się i chorobym tkankom⁸. Ostateczna realizacja tych wysiłków będzie wymagała szczegółowego zrozumienia zachowania przeszczepionych komórek w unikalnych mikrośrodowiskach, które różnią się od nieuszkodzonej, prawidłowej tkanki. Nasze prace wykazały, że w obrębie napromieniowanego łoża tkankowego, wszczepione w obszar czaszki NSC mogą funkcjonalnie przywrócić funkcje poznawcze, przeżywając, migrując i różnicując się w kierunku linii neuronalnych i glejowych². Obecnie nie jest jasne, w jaki dokładnie sposób komórki te pośredniczą w powrocie funkcji poznawczych, ale zależy to od przeprowadzenia serii starannie kontrolowanych procedur eksperymentalnych w sposób powtarzalny. Szczegółowo opisaliśmy tutaj te kluczowe procedury w celu przyspieszenia potencjału translacyjnego terapii komórkami macierzystymi w łagodzeniu niekorzystnych efektów poznawczych związanych z klinicznym leczeniem raka mózgu i innych postaci nowotworów. Poniżej wyróżniono dodatkowe kwestie, które mogą mieć istotny wpływ na jakość danych.

Terapie oparte na transplantacji wykorzystują komórki macierzyste jako kluczowy odczynnik, w związku z czym należy zachować szczególną staranność w celu właściwej charakterystyki kultur, utrzymania sterylności oraz stosowania dopasowanych numerów pasaży w celu zapewnienia wiarygodności wyników. Przeszczepione ludzkie komórki macierzyste zostały znakowane BrdU przed operacją, aby umożliwić ich śledzenie in vivo. W naszych warunkach eksperymentalnych przeszczepione NSCs nie ulegały intensywnej proliferacji, dzięki czemu rozcieńczenie znacznika BrdU nie stanowiło problemu. Alternatywnie, przeszczepione ludzkie komórki macierzyste można odróżnić od komórek gospodarza poprzez immunobarwienie na markery specyficzne dla ludzi, takie jak białko macierzy jądrowej (h-NUC lub hNUMA)⁹ lub ludzki specyficzny antygen jądrowy (HuNu)². Ludzkie komórki macierzyste można również znakować różnymi markerami fluorescencyjnymi, aby ułatwić ich identyfikację w mózgu gospodarza.

Precyzyjne określenie parametrów napromieniowania definiuje techniki dostarczania dokładnej dawki, a opisane tutaj procedury modelują aktualne praktyki kliniczne w radioterapii onkologicznej. Kluczowe jest również powtarzalne przeszczepianie komórek macierzystych do mózgu, co osiąga się przy użyciu cyfrowego instrumentu stereotaktycznego. Możliwość precyzyjnej mikromanipulacji mikrosstrzykawką podczas implantacji komórek macierzystych w małych strukturach mózgu, takich jak hipokamp, znacząco redukuje błąd ludzki. Przy użyciu tego aparatu NSC zostały przeszczepione w czterech różnych miejscach, obejmujących obszary od przedniej do tylnej części hipokampa szczura. Współrzędne grzbietowo-brzuszne (DV) określono na podstawie doświadczeń z beztymusowymi szczurami nago (ATN) w taki sposób, aby procedury chirurgiczne nie spowodowały uszkodzenia formacji hipokampa². Przekrój czołowy mózgu szczura ukazuje kluczowe struktury formacji hipokampa, w tym zakręt zębaty (DG), wzgórze zakrętu zębatego (DH) oraz podpola CA1 i CA3 (Rys. 8). Przeszczepione NSC, wprowadzone grzbietowo wzdłuż widocznego toru igły (Nt, czerwona linia), są widoczne jako ciemno barwiące się (brązowe) komórki zdeponowane w miejscu uwolnienia przeszczepu (Tr) tuż poniżej ciała modzelowatego (CC), które następnie migrują wzdłuż osi przegrodowo-skroniowej hipokampa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cyfrowy instrument stereotaktyczny z uchwytami do uszu 45° i 18°	Zestaw chirurgiczny do transplantacji czaszkowej	Leica Microsystems	39463501	Przydatne akcesoria: Stolik z podgrzewaczem i regulowanym źródłem prądu (do utrzymania temperatury ciała podczas operacji)