1. Przygotowanie eksperymentalne
- Przygotuj płyty pokryte matrycą membrany podstawnej (BMM).
nuta: BMM krzepnie szybciej w cieplejszych temperaturach. Płytki należy przygotować szybko i natychmiast umieścić w temperaturze 4 °C w celu przechowywania.
- Rozmrażać BMM (patrz tabela materiałów) na lodzie w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
- Wymieszaj Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 i BMM do końcowego stężenia 80 μg/ml. Rozprowadzić roztwór BMM na szalkach do hodowli tkankowych (1 ml dla szalek 35 mm i 2 ml dla szalek 60 mm) i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc przed posiewem komórek.
UWAGA: Niewykorzystane naczynia można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie.
- Przygotować płytki pokryte poli-L-ornityną/lamininą (PLO/laminina).
- Przygotować 20 μg/ml PLO (patrz tabela materiałów) w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS+/+) i dodać 1 ml do każdego dołka na płytce 6-dołkowej. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
- Następnego dnia odessać PLO za pomocą aspiratora próżniowego i umyć dwa razy DPBS+/+. Suszyć na powietrzu w kapturze.
UWAGA: Talerze wysuszone na powietrzu można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni, zawinięte w folię aluminiową, do wykorzystania w przyszłości.
- Przygotować 10 μg/ml lamininy (patrz tabela materiałów) w DPBS+/+ i dodać 1 ml do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Inkubować w inkubatorze przez co najmniej 3 godziny lub przez noc w temperaturze 37 °C.
- Odessać lamininę za pomocą aspiratora próżniowego i dodać 1 ml pożywki lub sterylnego DPBS+/+.
UWAGA: Powłoka z lamininy nie może wyschnąć. Aby temu zapobiec, należy natychmiast dodać PBS lub odpowiednią pożywkę. Powlekane talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
- Przygotuj roztwór pasażujący PSC.
- Rozpuścić 11,49 g chlorku potasu (KCl) i 0,147 g dwuwodnego cytrynianu sodu (HOC(COONa) (CH,2, COONa)2*2H2O) w 400 ml sterylnej wody o czystości do hodowli komórkowych (patrz tabela materiałów).
- Zmierzyć objętość roztworu i zapisać ją jako objętość początkową (Vi).
- Zmierz osmolarność i dostosuj ją do 570 mOsm, dodając sterylną wodę klasy do hodowli komórkowych przy użyciu wzoru Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Przefiltruj i wysterylizuj roztwór za pomocą filtra 0,20 μm i przygotuj 10 ml porcji. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do 6 miesięcy.
- Przygotować podłoże z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC).
UWAGA: iPSC są utrzymywane w pożywce zawierającej stabilny termicznie czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) (patrz tabela materiałów), zapewniając harmonogram karmienia bez weekendów. Inne dostępne na rynku nośniki PSC nie zostały wypróbowane pod kątem tego protokołu.
- Rozmrozić suplement pożywki PSC przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dodać 10 ml pożywki PSC do 500 ml podstawowej pożywki PSC. Przygotować 25 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
UWAGA: Zamrożone porcje można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6 miesięcy. Rozmrożone podwielokrotności muszą być przechowywane w temperaturze 4 °C i zużyte w ciągu 2 tygodni. Komórki można zamrozić w celu długotrwałego przechowywania w pożywce PSC z 10% (v/v) dimetylosulfotlenkiem (DMSO).
- Przygotować podłoże do rozmrażania PSC.
- Suplement pożywki PSC z 50 nM chroman, 1,5 μM emricasan, 1x suplementem poliaminowym i 0,7 μM trans-ISRIB (koktajl CEPT) (patrz tabela materiałów).
- Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.
- Przygotuj pipety z wyciągniętego szkła.
- Przeciągnij szklane pipety Pasteura o długości 22,9 cm (9 cali) na dwie części nad palnikiem Bunsena, ~2 cm poniżej szyjki, tworząc dwie pipety, przy czym cieńsza strona jest ~4 cm krótsza od drugiej.
- Za pomocą płomienia zegnij końcówki ciągniętej strony, aby uzyskać gładkie "r".
- Umieść wyciągnięte pipety w rękawach autoklawu i autoklawie do sterylizacji.
- Przygotuj pożywkę do różnicowania móżdżku (CDM).
- Wymieszaj Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) i mieszankę składników odżywczych F12 firmy Ham's w proporcji 1:1. Uzupełnij mieszankę 1x suplementem L-alaniny-L-glutaminy, 1% (v/v) chemicznie zdefiniowanym koncentratem lipidowym, 0,45 mM 1-tio-glicerolem, 15 μL/ml apo-transferyny, 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 7 μg/ml insuliny (patrz Tabela Materiałów).
- Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.
- Przygotuj pożywkę do dojrzewania móżdżku (CMM).
- Uzupełnij podłoże neuropodstawowe 1x suplementem L-alaniny-L-glutaminy i 1x suplementem N-2 (patrz Tabela Materiałów).
- Filtrować-sterylizować filtrem 0,20 μm, przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 2 tygodni.
2. Hodowla iPSC bez feederów
- Rozmrozić komórki, wykonując poniższe czynności.
- Umieścić płytkę BMM (krok 1.1) w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu żelowania przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc przed rozmrożeniem komórek.
- Ogrzać 10 ml pożywki do rozmrażania PSC (krok 1.5) w temperaturze 37 °C.
- Przenieść kriowial z komórkami z ciekłego azotu do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
UWAGA: Aby uniknąć generowania źródła zanieczyszczenia w przestrzeni hodowli komórkowej, nie zaleca się stosowania standardowej kąpieli wodnej. Zamiast tego słodką wodę można podgrzać w małej zlewce do temperatury 37 °C, aby uzyskać jednorazową kąpiel wodną.
- Gdy w probówce pozostanie mały kawałek lodu, wyjmij go z łaźni wodnej, osusz probówkę i spryskaj 70% etanolem. Przenieść probówkę do kaptura i za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 ml lub 5 ml (patrz tabela materiałów) delikatnie przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Dodaj kroplami 8 ml pożywki do rozmrażania PSC do komórek, jednocześnie obracając stożkową probówkę. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie odessać supernatant za pomocą aspiratora próżniowego, nie naruszając osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml pożywki do rozmrażania PSC.
- Odessać BMM z płytki i dodawać zawieszone komórki kroplami po całej płytce, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie.
- Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Odśwież pożywkę następnego dnia za pomocą pożywki PSC. Następnie codziennie zmieniaj podłoże.
- Utrzymuj komórki, wykonując poniższe czynności.
- Podgrzej wstępnie niezbędną objętość pożywki PSC w temperaturze 37 °C (np. 1 ml pożywki na płytkę 35 mm).
- Zbadać płytki w poszukiwaniu zróżnicowanych komórek lub kolonii i usunąć zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety (krok 1.6).
UWAGA: kolonie iPSC mają gładkie krawędzie z morfologicznie identycznymi komórkami.
- Zmieniaj zużyte podłoże codziennie i przechodź co 3-4 dni lub po osiągnięciu 70% zbiegu.
- Przejdź przez komórki.
- Umieścić niezbędną ilość płytek BMM w inkubatorze na co najmniej 1 godzinę lub na noc przed pasażem. Wstępnie podgrzać niezbędną ilość pożywki PSC (krok 1.3) w temperaturze 37 °C.
- Za pomocą wyciągniętej szklanej pipety usuń wszelkie zróżnicowane komórki lub kolonie.
- Odessać zużytą pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i dodać pożywkę dysocjacyjną PSC, 1 ml na szalkę 35 mm. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-3 minuty
UWAGA: Jeśli kolonie unoszą się w roztworze pasażującym PSC przed dodaniem pożywki PSC, czas inkubacji można skrócić.
- Zassać roztwór pasażowy PSC i dodać wstępnie podgrzane podłoże PSC.
- Za pomocą sterylnej końcówki do pipet o pojemności 200 μl zarysuj linie równolegle do siebie w jednym kierunku, obróć płytkę o 90° i wykonaj drugi zestaw linii zadrapań prostopadłych do poprzednich (tworząc kreskowany wzór w poprzek płytki).
- Odessać roztwór BMM z ustawionych płytek. Zebrać kolonie za pomocą pipety serologicznej i rozprowadzić je na nowych płytkach BMM.
- Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj medium codziennie.
- Zamroź komórki.
- Przygotuj kriowialisty, oznaczając zawartość i sterylizuj w świetle ultrafioletowym (UV) w kapturze (patrz tabela materiałów) przez 30 minut.
- Przygotować pożywkę do zamrażania PSC, uzupełniając pożywkę PSC 10% (v/v) DMSO. Wykonaj kroki 2.3.2-2.3.5.
- Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z pipetą serologiczną o pojemności 5 ml i odwirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Ostrożnie odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórek w pożywce do zamrażania PSC.
- Rozprowadzić do kriowialiów. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania i umieścić pojemnik w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Następnego dnia przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
3. Różnicowanie móżdżku
UWAGA: Przed rozpoczęciem różnicowania, iPSC są przenoszone do sześciu szalek 35 mm i są gotowe do różnicowania, gdy są przy 70% zbieżności. Każda płytka o średnicy 35 mm zostanie przeniesiona do jednego dołka płytki 6-dołkowej.
- W dniu 0 podnieś zdrowe kolonie iPSC w celu utworzenia EB.
- Dodać 1 ml CDM (krok 1.7) uzupełniony 10 μM Y-27632 i 10 μM SB431542 (patrz tabela materiałów) do każdej studzienki 6-dołkowej płytki o bardzo niskim przyłączeniu (ULA) i umieścić w inkubatorze, aż podniesione kolonie będą gotowe do dodania do studzienek.
- Oczyść zróżnicowane komórki za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Zassać pożywkę i dodać 1 ml roztworu pasażującego PSC na każdą szalkę o średnicy 35 mm. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C, aspirować i dodać 2 ml CDM uzupełnionego 10 μM Y-27632 i 10 μM SB431542,
nuta: Jeśli kolonie unoszą się w roztworze pasażującym PSC przed dodaniem CDM, czas inkubacji można skrócić.
- Pod mikroskopem odwróconym ze światłem przechodzącym delikatnie podnieś kolonie za pomocą wygiętej krawędzi wyciągniętej szklanej pipety przy 4-krotnym powiększeniu. Po podniesieniu każdej kolonii delikatnie przenieś ją do jednego dołka 6-dołkowej płytki ULA za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Powtórz ten proces dla każdej płytki iPSC. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
nuta: Jeśli kolonie są zbyt duże lub są połączone, można je pokroić końcówką wyciągniętej szklanej pipety, aby uzyskać mniejsze EB.
- W dniu 2 dodaj FGF2 do każdej studzienki do końcowego stężenia 50 ng/mL.
nuta: FGF2 używany do różnicowania móżdżku nie jest stabilny termicznie. Ten protokół nie został przetestowany z termostabilnym FGF2.
- W dniu 7 wykonaj 1/3 średniej zmiany. W przypadku 3 ml całkowitej pożywki w studzience, za pomocą pipetora o pojemności 1 000 μl, delikatnie odessać 1 ml zużytej pożywki i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki. Inkubuj EB przez 7 dni.
- W 14 dniu delikatnie odessać prawie całą zużytą pożywkę za pomocą pipetora o pojemności 1 000 μl. Aby zapewnić minimalne uszkodzenie EBs, zakręć płytką, aby zebrać wszystkie EB na środku płytki, a następnie przechyl płytkę i powoli odsysaj od krawędzi.
- W miarę zmniejszania się ilości podłoża powoli ułóż płytkę płasko i kontynuuj aspirację. Pozostaw wystarczającą ilość podłoża, aby uniknąć wysuszenia EB. Następnie dodaj 3 ml świeżego CDM uzupełnionego 10 μM Y-27632. Przenieść EBs za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do naczynia pokrytego PLO/lamininą (krok 1.2).
nuta: W zależności od dalszego zastosowania, EB mogą być przenoszone na 6-dołkową płytkę PLO/lamininową lub pojedyncze EB mogą być przenoszone do pojedynczego dołka 24-dołkowej płytki lub szkiełka nakrywkowego pokrytego PLO/lamininą.
- W 15 dniu odessać pożywkę i zastąpić ją świeżym CDM.
nuta: Ważne jest, aby dodać wystarczającą ilość pożywki do studzienek, aby zapewnić wystarczającą ilość pożywki między karmieniami, ponieważ z czasem nastąpi parowanie (np. w przypadku studzienki na płytce 6-dołkowej dodaj 3 ml pożywki). Jeśli podłoże zaczęło się zakwaszać (zmienia kolor na klarowny i żółty), odśwież podłoże, nawet jeśli nie ma go w harmonogramie karmienia do końca protokołu.
- W dniu 21 odessać zużytą pożywkę i zastąpić ją maszyną współrzędnościową. W 28 dniu zmień podłoże na świeżą maszynę współrzędnościową. W 35 dniu zbierz komórki do dalszych zastosowań.
