$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Różnicowanie HiPSC na mieszane neurony i glej
UWAGA: Procedura trwa około 28 dni, a główne kroki przedstawiono na rysunku 1.
- Wytwarzanie ciał zarodków (EB) (dni 0 → 1)
UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji. Fragmenty kolonii HiPSC (ang. human induced pluripotent stem cells) powinny być jednakowej wielkości, aby w kolejnych krokach otrzymać jednorodne ciała zarodkowe (EB). Morfologicznie zróżnicowane kolonie (z dużymi frakcjami cytoplazmatycznymi i małymi jąderkami) należy odrzucić.
- Odświeżyć pożywkę hiPSC (3 ml/60 mm szalka Petriego) przed cięciem niezróżnicowanych kolonii hiPSC (o średnicy około 1 mm, patrz rysunek 2A) w sterylnych warunkach.
- Pokrój niezróżnicowane kolonie (jak pokazano na rysunku 2A i rysunku 2B) na fragmenty o wymiarach około 200 μm x 200 μm za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G. Użyj mikroskopu stereoskopowego przy 4-krotnym powiększeniu w komorze laminarnej w temperaturze pokojowej.
- Odłącz fragmenty kolonii od powierzchni naczynia za pomocą pipety o pojemności 200 μl, delikatnie pipetując podłoże pod spodem, aby podnieść kawałki.
- Przenieś wszystkie oderwane fragmenty i pożywkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
- Opłucz naczynie 2 ml kompletnej pożywki hiPSC, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
- Wirować przy 112 x g przez 1 min.
- Odessać supernatant i delikatnie zawiesić fragmenty w 5 ml kompletnej pożywki hiPSC EB (patrz tabela materiałów).
- Umieść fragmenty kolonii na szalce Petriego o bardzo niskim nasadce o średnicy 60 mm (5 ml/60 mm szalka Petriego).
- Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
- Następnego dnia (dzień 1) zebrać EBs i ich pożywkę do probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
- Odwirować EB przy 112 x g przez 1 minutę.
- Ostrożnie odessać supernatant i delikatnie zawiesić EB w 5 ml kompletnej pożywki hiPSC EB za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml.
- Ponownie umieść EB na nowej szalce Petriego o bardzo niskim nasadce 60 mm (5 ml/60 mm szalka Petriego).
- Inkubować szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .
- W dniu 1 pokryj naczynia macierzą błony podstawnej (np. matrigelem, zwanym dalej "matrycą standardową") lub innym odpowiednim substratem białkowym (np. lamininą).
- Przechowywać wzorcową matrycę (patrz tabela materiałów) w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach 200 μl, używając zimnych probówek o pojemności 1,5 ml i zimnych pipet o pojemności 5 lub 10 ml.
- Rozmrozić 200 μl wzorcowej matrycy na lodzie.
- Rozcieńczyć 200 μl wzorcowej matrycy w 20 ml podłoża podstawowego (DMEM/F12) (rozcieńczenie 1:100).
- Tym roztworem pokryj 60-milimetrowe szalki Petriego (5 ml na szalkę).
- Inkubować panierowane naczynia w temperaturze 37 °C przez noc.
nuta: Naczynia te będą używane do nakładania EB (około 50 EB/naczynie) i generowania agregatów neuroepitelialnych (rozet); Zobacz krok 1.3.
- Wytwarzanie agregatów neuronabłonkowych (rozet) (dni 2 → 7)
- W dniu 2 usunąć wzorcowy roztwór powlekający matrycę z 60-milimetrowych szalek Petriego (nie ma potrzeby płukania płytek) i napełnić je 5 ml na szalkę kompletnej pożywki do indukcji neuroepitelialnej (NRI); patrz Tabela materiałów.
- Przenieś pływające EBs (z kroku 1.1.14) na powlekane naczynia (~50 EBs/talerz) za pomocą pipety 200 μL pod mikroskopem stereoskopowym przy 4-krotnym powiększeniu i umieść w komorze laminarnej.
nuta: Bardzo ważne jest, aby wybrać jednorodne, średniej wielkości EB (o średnicy ~200-300 μm). Zbyt małe EB mogą nie przetrwać dobrze podczas różnicowania neuroektodermalnego, podczas gdy zbyt duże EB mają tendencję do ulegania martwicy rdzenia.
- Inkubować naczynia w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Dzień po (dzień 3) sprawdź naczynia pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że wszystkie EB są przymocowane.
- Delikatnie przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki za pomocą kompletnego podłoża NRI.
- Zmieniaj pożywkę NRI co drugi dzień do 7 dnia, kiedy powinny być widoczne agregaty neuronabłonkowe (rozety).
- W dniu 7 pokryć standardową matrycę (lub lamininę), jak opisano w kroku 1.2, na dowolny wymagany format płytki lub szalki: płytki 96-dołkowe (100 μl/dołek), płytki 24-dołkowe (250 μl/dołek), płytki 12-dołkowe (500 μl/dołek), wióry MEA (do aktywności elektrycznej, 1 ml/wiór jednodołkowy) lub szalki Petriego o średnicy 60 mm (4 ml/szalkę).
- Inkubować powlekane płytki/szalki przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Dysocjacja rozety i różnicowanie neuronalne (dni 8 → 28)
UWAGA: Zabieg ten wymaga dobrych zdolności manualnych i precyzji. Aby uniknąć zbierania komórek mezodermalnych i endodermalnych, należy dysocjować i zebrać tylko struktury przypominające rozetę ektodermy.
- W dniu 8 pokrój struktury przypominające rozetę na fragmenty pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu w sterylnych warunkach. Użyj strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G. Zwróć uwagę, że rozety mają tendencję do odklejania się od naczynia po łatwym dotknięciu igłą.
- Zakończ odłączanie fragmentów rozety za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
- Przenieś naczynie pod okap z przepływem laminarnym i zbierz fragmenty rozety oraz ich podłoże do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1, 2 lub 5 ml. Opłucz naczynie 2 ml pożywki NRI, aby odzyskać wszystkie fragmenty.
- Wirować fragmenty rozety w odległości 112 x g przez 2 min.
- Odessać supernatant.
- Delikatnie ponownie zawiesić osad w 1 ml 1x DPBS (bez wapnia i magnezu) i delikatnie pipetować fragmenty rozety w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, aby częściowo je oddzielić.
- Dodać 4 ml kompletnej pożywki NRI i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek (patrz Tabela Materiałów)
nuta: Rozcieńczyć 20 μl zawiesiny komórkowej w 20 μl błękitu trypanowego. Etap ten można pominąć, jeżeli komórki nie mogą zostać wprowadzone do zawiesiny jednokomórkowej. Jeśli fragmenty rozety nie wyglądają na całkowicie zdysocjowane, fragmenty rozety pochodzące z około 50 EBs/60-milimetrowej szalki można ponownie zawiesić w 50 ml kompletnej pożywki NRI i platerować, jak wskazano w tabeli 1.
- Odessać roztwór powlekający wzorcową matrycę (lub lamininę) z szalek Petriego, płytek i/lub wiórów MEA (od kroku 1.3.7). Nie pozwól im wyschnąć.
- Umieść komórki w kompletnym podłożu NRI zgodnie z planem badania (około 15 000 komórek/cm2; patrz Tabela 1 dla wskazań objętości posiewu).
- Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- W dniu 10 należy przeprowadzić całkowitą zmianę pożywki przy użyciu pożywki z pełnym różnicowaniem neuronalnym (ND); patrz Tabela Materiałów.
- Odświeżaj kompletną pożywkę ND dwa razy w tygodniu aż do 28 dnia.
Tabela 1.
Uwaga na temat gęstości posiewu rozety zdysocjowanej: jeśli fragmenty rozety nie wyglądają na całkowicie zdysocjowane, aby osiągnąć gęstość posiewu komórek około 15.000 komórek/cm2, zdysocjowane fragmenty rozety pochodzące z około 50 EBs/1 x 60mm-szalka mogą być ponownie zawieszone w 50 ml kompletnego podłoża NRI i posiane w następujący sposób (w zależności od formatu płytki):
| Płytki wielodołkowe / MEA | Obszar wzrostu (cm2/studzienkę) | Objętość zawiesiny komórek do płytki na dołek (lub chip MEA) | Maksymalna liczba płytek, które można posiać (z 50 ml zawiesiny komórek) |
| 96 studni | 0,3 | 100 ul | 5 |
| 48 studni | 0,7 | 220 ul | 4 |
| 24 dołki | cyfra arabska | 625 ul | 3 |
| 12 studni | 4 | Pojemność 1,25 ml | 3 |
| 6 dołków | 10 | 3,125 ml | cyfra arabska |
| Pojedynczy dołek MEA | 3,5 | 1,1 ml | Rozdział 45 |
