Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Dysocjacja komórek brzusznego śródmózgowia
- Przenieś kawałki brzusznej części śródmózgowia pod kaptur z przepływem laminarnym. Usuń zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego (37 ºC) 0,05% kwasu trypsyno-etylenodiaminotetraoctowego (trypsyna-EDTA) do stożkowej rurki (objętość wystarczająca na 12 kawałków brzusznego śródmózgowia). Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
- Usuń trypsynę-EDTA pod maską i dodaj 1 ml pożywki dezaktywującej (surowica dezaktywuje trypsynę) do tkanki.
- Usunąć pożywkę dezaktywującą i dwukrotnie umyć chusteczkę w 1 ml kompletnej pożywki.
nuta: Aby zapobiec wyrzuceniu zdysocjowanych komórek, należy unikać wyjmowania całego podłoża z probówki i pipetowania tkanki.
- Dodać 1 ml kompletnego podłoża i rozcierać tkankę za pomocą pipety ze szkła polerowanego ogniowo. Unikać tworzenia się pęcherzyków i kontynuować rozcieranie, aż do uzyskania zawiesiny jednokomórkowej.
UWAGA: Zwykle do całkowitej dysocjacji wymagane jest 8-10 przejść przez ograniczoną końcówkę.
- Odwirować komórki o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i usunąć pożywkę.
- Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnego podłoża, powoli pipetując w górę i w dół do czterech razy.
2. Poszycie komórek brzusznego śródmózgowia
- Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z 90 μl roztworu błękitu trypanowego i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
nuta: Na tym etapie można również sprawdzić żywotność komórek.
- Umieść wysterylizowane nakrętki probówek do mikrowirówek na szalkach Petriego o średnicy 100 mm i przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte poli-L-ornityną/laminą, używając kleszczyków, pojedynczo na wierzch nakrętek.
nuta: Nie myj szkiełek nakrywkowych i unikaj suszenia lamininy, ponieważ może to spowodować nierówne hodowle i zmniejszyć przeżywalność komórek.
- Dostosuj objętość do 1 500 komórek na 1 μl, dodając całe podłoże i 100 μl (łącznie 150 000 komórek) zawiesiny komórek na wierzchu każdego szkiełka nakrywkowego (objętość jest optymalna, aby pokryć powierzchnię szkiełka nakrywkowego bez rozlewania). Zamknąć szalki Petriego i inkubować je przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2).
nuta: ETAP KRYTYCZNY: Ten krok jest wymagany w celu zwiększenia przyczepności i żywotności komórek oraz zwiększenia liczby szkiełek nakrywkowych na zarodek. Alternatywnie komórki można przenieść bezpośrednio do studzienek (zawierających szkiełka nakrywkowe), ale liczba komórek powinna zostać zwiększona do 350 000 na studzienkę (zamiast 150 000). Innymi słowy, stosując tę metodę, można uzyskać 8-10 szkiełek nakrywkowych, podczas gdy bezpośredni transfer daje około 3-4 szkiełka nakrywkowe ze względu na komórki, które przyczepiają się do płytek (obok lub pod szkiełkami nakrywkowymi). Średnia żywotność kultur przy użyciu tej metody wynosiła około 90%.
3. Rozwój i utrzymanie kultury
- Po 1 godzinie inkubacji ostrożnie przenieść szkiełka nakrywkowe, łącznie z pożywką, na 24-dołkowe płytki zawierające 400 μl wstępnie ogrzanej (do 37 °C) kompletnej pożywki (całkowita objętość: 500 μl). Inkubować komórki przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C.
- W ciągu 24 godzin po inkubacji studzienek delikatnie dodać 500 μl kompletnej pożywki do każdej studzienki.
UWAGA: Pierwsze kilka godzin jest najbardziej krytycznym etapem dla przeżycia neuronów dopaminergicznych, a liczba komórek, które przeżyły, nie zmienia się znacząco poza tym punktem.
- Nie dodawaj dodatkowych pożywek do kultur przez pierwsze dwa tygodnie lub do momentu, gdy podłoże stanie się żółte. Jeśli hodowla trwa dłużej niż dwa tygodnie lub kolor podłoża zmieni się na żółty, należy wymienić połowę pożywki (500 μl) na świeżą, kompletną, wstępnie podgrzaną pożywkę (zwykle co dwa tygodnie).
nuta: Neurony dopaminergiczne w kulturach przetrwałyby w tych warunkach przez ponad sześć tygodni.
