Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Pobieranie próbek tkanek
UWAGA: Krytyczny element tego protokołu wymaga właściwego postępowania z pobraniem tkanki, począwszy od razu po autopsji. Ogólna żywotność próbki zależy w znacznym stopniu od zminimalizowania interwału pośmiertnego (PMI), natychmiastowego przeniesienia tkanki do odpowiedniego zimnego podłoża uzupełnionego antybiotykami/środkami przeciwgrzybiczymi, utrzymywania próbki na mokrym lodzie przez cały transport i utrzymania sterylnej techniki przez cały protokół.
- Po otrzymaniu powiadomienia o zbliżającej się dawce przygotuj zestaw do pobierania próbek. Korzystając z pudełka transportowego z izolowanym pojemnikiem, który może być bezpośrednio użyty do transportu zwrotnego próbki tkanki, dołącz następujące materiały:
- Dołącz materiały do sterylnego przygotowania, w tym sterylne rękawiczki, serwety i skalpele.
- Dołącz 8 - 10 sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 30 ml pożywki transportowej w izolowanym pojemniku z lodem lub zimnymi wkładami.
nuta: Chociaż każda standardowa pożywka do hodowli komórkowych może działać, najlepszą żywotność próbki uzyskuje się za pomocą Hibernate-A uzupełnionego antybiotykiem/antybiotykiem.
- Dołączyć wszelkie dalsze probówki z próbkami do innych analiz (np. utrwalaczy).
- Jeśli sekcja zwłok nie zostanie przeprowadzona na miejscu badacza, dołącz dokument, który jasno określa, jak pobrać próbkę guza. Obejmuje to takie szczegóły, jak utrzymanie sterylności, trzymanie probówek z próbkami na mokrym lodzie oraz dołączanie próbek ze śródmózgowia i rdzenia, ponieważ komórki nowotworowe często atakują te obszary.
- Zachowaj sterylność podczas autopsji. Weź pod uwagę, że mózg jest sterylny wewnątrz czaszki, więc obserwuj sterylną technikę (w tym zmianę rękawiczek), gdy czaszka jest otwarta. Unikanie zanieczyszczenia skóry i włosów ma kluczowe znaczenie.
- Wypreparuj guz od strony brzusznej ("brzuch" mostu, patrz ryc. 1). Za pomocą sterylnego skalpela odetnij małe 1 cm kawałki guza i natychmiast przenieś do zimnego podłoża transportowego (patrz UWAGA w kroku 1.1.2) i połóż na mokrym lodzie. Umieść 10 ml tkanki w każdej probówce, uzyskując końcową objętość tkanki i pożywki w każdej probówce wynoszącą 40 ml.
nuta: W przypadku rozlanego glejaka mostu wewnętrznego (DIPG) guz nacieka dylanowo do mostu i często do reszty pnia mózgu. W związku z tym należy pobrać jak najwięcej próbki, zwykle w tym 3-4 probówki (30-40 ml tkanki) z mostu i 1-2 probówki (10-20 ml tkanki) każda ze śródmózgowia i rdzenia.
- Zbierz próbki ze śródmózgowia i rdzenia zestawione z mostem, który często zawiera wiele komórek nowotworowych.
- Po pobraniu próbki należy wysłać przez noc (O/N) na mokrym lodzie w izolowanym pojemniku. Nie wysyłaj próbki na suchym lodzie, ponieważ zamrożenie zabije komórki.
2. Przygotowanie do przetwarzania próbek
- Przed rozpoczęciem przygotowywania próbki należy wysterylizować kaptury do hodowli tkankowych wraz z żyletkami, zakrzywionymi hemostatykami i innymi niesterylnymi narzędziami w świetle ultrafioletowym (UV) przez 1 godzinę. Wykonaj wszystkie poniższe czynności w sterylnych warunkach, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur.
- Przygotować i sterylne roztwory filtracyjne.
- Aby przygotować 1,8 M roztwór sacharozy, rozpuść 308,07 g sacharozy w 300 ml wody destylowanej. Dodaj 50 ml 10x buforowany roztworem soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) bez wapnia i magnezu i zwiększ całkowitą objętość do 500 ml za pomocą wody destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Aby przygotować roztwór do wytrawiania enzymatycznego, należy pobrać 50 ml HBSS z wapniem i magnezem na każde 10 ml tkanki mielonej i dodać 500 μl 5 mg/ml deoksyrybonukleazy I (stężenie końcowe 50 μg/ml), 500 μL 2,5 mg/ml kolagenazy I/II i roztwór dyspazy (końcowe stężenie 25 μg/ml), i 500 μl 1 M buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES). Wstępnie podgrzej roztwór wytrawiający w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Aby przygotować podłoże z pnia nowotworu (TSM), wymieszaj 250 ml Neurobasal-A, 250 ml Dulbecco's Modified Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F12 (DMEM/F12), 5 ml 100x antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy, 5 ml 200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy (GlutaMAX-A), 5 ml buforu HEPES, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu i 5 ml 100x MEM aminokwasów endogennych.
- Aby przygotować kompletny TSM z czynnikami wzrostu, dodaj następujące suplementy do bazy TSM: 50x B27 Suplement Minus Witamina A (1:50), ludzki naskórkowy czynnik wzrostu (H-EGF, 20 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu fibroblastów (H-FGF, 20 ng/ml), ludzki płytkopochodny czynnik wzrostu AA (H-PDGF-AA, 10 ng/ml), ludzki czynnik wzrostu pochodzenia płytkowego BB (H-PDGF-BB, 10 ng/ml) i roztwór heparyny (2 μg/ml).
- Schłodzenie wirówki laboratoryjnej wyposażonej w obracający się wirnik kubełkowy do temperatury 4 °C.
3. Dysocjacja mechaniczna
- Przenieść tkankę do wysokościennego naczynia do hodowli komórkowej o wymiarach 100 mm x 20 mm. Usuń pozostałą pożywkę z transportu i zastąp ją 10-15 ml zimnej pożywki hodowlanej.
- Używając zakrzywionych hemostatów do chwycenia żyletki, drobno zmiel tkankę, usuwając widoczne naczynia krwionośne lub opony mózgowe.
nuta: Końcowe fragmenty tkanki powinny być mniejsze niż 1 mm (patrz ryc. 2B).
- Przenieś tkankę do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj naczynie do hodowli komórkowych dodatkowym 5 ml zimnej pożywki hodowlanej i przenieś do stożkowej probówki. W razie potrzeby powtórz ten etap mycia, aby przenieść pozostałą tkankę.
- Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie rozetrzeć (4 - 5 razy). Pozwól, aby większe fragmenty tkanki osiadły na dnie probówki. W razie potrzeby krótko odwirować próbkę przez 1 minutę (350 x g, 4 °C).
- Zbierz frakcję mechanicznie zdysocjowaną.
- Usunąć supernatant i przefiltrować go przez filtr 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja mechaniczna". Odwróć filtr nad oryginalną stożkową probówką i przemyj pożywką hodowlaną w celu odzyskania fragmentów tkanki.
- Odwirować frakcję "dysocjacji mechanicznej" przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
- Usunąć supernatant z granulowanej frakcji "dysocjacji mechanicznej" i ponownie zawiesić tkankę w zimnej pożywce hodowlanej. Jeśli w stożkowej probówce "Dysocjacja mechaniczna" znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, podziel tkankę na inne stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.
- Mechanicznie zdysocjowaną frakcję przechowywać na lodzie do momentu etapu wirowania w gradiacji sacharozy (etap 5). Alternatywnie, frakcja zdysocjowana mechanicznie może przejść do etapu 5 podczas okresu inkubacji dysocjacji enzymatycznej (etap 4.4).
4. Dysocjacja enzymatyczna
- Jeśli w probówce zawierającej pozostałe większe fragmenty tkanki znajduje się więcej niż 5 ml tkanki, należy podzielić tkankę na inne nowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml tak, aby żadna probówka nie zawierała więcej niż 5 ml tkanki.
- Odwirować stożkową probówkę (stożki) zawierającą pozostałe fragmenty tkanek przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
- Usunąć supernatant i dodać wstępnie podgrzany roztwór do wytrawiania enzymatycznego, tak aby na każdy 1 ml tkanki przypadało 5 ml roztworu wytrawiającego (np. 25 ml roztworu do wytrawiania na 5 ml tkanki).
- Uszczelnić stożkowe pokrywki probówek folią laboratoryjną i inkubować reakcję na rotatorze w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Po inkubacji próbki należy delikatnie rozcierać (zob. rysunek 2C).
- Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml pipetować próbkę w górę i w dół 6 - 8 razy. Unikaj generowania nadmiernej ilości pęcherzyków powietrza.
- Dodać końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl na koniec pipety i rozcierać dodatkowe 6-8 razy.
- Pozwól, aby pozostałe kawałki osiadły na dnie tuby. Usunąć i przefiltrować supernatant z komórkami nadal zawieszonymi w filtrze 100 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z napisem "Dysocjacja enzymatyczna" i przechowywać na lodzie.
- Jeśli pozostaną znaczne fragmenty tkanki, dodać do nich dodatkowe 10 ml HBSS z wapniem i magnezem i powtórzyć kroki 3.5.1 i 3.5.2. Przefiltrować ten końcowy roztwór przez filtr 100 μm do probówki "dysocjacja enzymatyczna".
- Odwirować probówkę "dysocjacja enzymatyczna" przez 5 minut (350 x g, 4 °C) i kontynuować wirowanie w gradiacji sacharozy.
5. Wirowanie w gradiencie sacharozy
- Jeżeli próbki są nadal zawieszone w roztworze, odwirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 20 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu. Zwiększyć objętość do 25 ml za pomocą zimnego HBSS.
- Powoli dodać 25 ml 1,8 M roztworu sacharozy i odwrócić probówkę, aby wymieszać. Daje to gradient sacharozy 0,9 M.
- Wirówka bez hamulca przez 10 min (800 x g, 4 °C). Użycie hamulca wirującego zakłóci gradient i zmniejszy wydajność (patrz rysunek 2D dla przykładu próbki przed i po odwirowaniu).
- Ostrożnie odessać resztki mieliny i jak najwięcej roztworu sacharozy. Przemyć próbkę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu i delikatnie mieszając. Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
6. ACK Liza czerwonych krwinek
- Usunąć supernatant z przemywania płucz. Dodać 5 ml buforu do lizy ACK i delikatnie zawiesić osad komórkowy, obracając probówkę przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Ugasić lizę, dodając 30 ml zimnego HBSS bez wapnia i magnezu.
- Wirować przez 5 minut (350 x g, 4 °C).
7. Początkowe utrzymanie kultury
- Zawiesić końcowe granulki komórek w 10 - 15 ml ciepłym, kompletnym TSM z czynnikami wzrostu i określić ilościowo gęstość żywotnych komórek na hemocytomeserze za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego.
nuta: Zakres żywotnych komórek różni się znacznie w zależności od okoliczności dawstwa tkanki, a kwantyfikacja może być trudna na tym wczesnym etapie ze względu na resztki resztek komórkowych. W idealnym przypadku należy dążyć do tego, aby na próbkę przypadało milion żywych komórek. W przypadkach, gdy pozostaje nadmierna ilość zanieczyszczeń, rozpylić płytkę o mniejszej gęstości w kolbie T175.
- Przenieść końcowe zawiesiny komórek do nowej kolby hodowlanej T75. Skok dodatkowych czynników wzrostu co drugi dzień, aby utrzymać ogólny poziom czynnika wzrostu i monitorować rozwój neurosfer komórek nowotworowych (patrz Rysunek 2E i Rysunek 3).
