Różnicowanie nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego w neurony ruchowe

Streszczenie

Źródło: Taga, A. et al., Ustanowienie Platformy Elektrofizjologicznej do Modelowania ALS z Regionalnie Specyficznymi Ludzkimi Pluripotencjalnymi Astrocytami i Neuronami Pochodzącymi z Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film prezentuje metodę różnicowania nerwowych komórek progenitorowych rdzenia kręgowego (NPC) w neurony ruchowe. Szczegółowo opisuje proces hodowli NPC na powlekanej płytce hodowlanej przy użyciu specjalistycznych pożywek wzbogaconych specyficznymi inhibitorami, których celem jest ułatwienie różnicowania NPC w dojrzałe neurony ruchowe.

Protokół

1. Rozmrażanie kultur komórek progenitorowych (NPC)

1. Posmaruj 10 cm płytki poliornityną (PLO) i lamininą na dzień przed rozmrożeniem komórek.
   1. Dodać 5 ml PLO rozcieńczonego do 100 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub wodzie destylowanej (dH₂O) na płytki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
   2. Odessać roztwór PLO i trzykrotnie przepłukać płytki PBS. (PLO jest toksyczny, jeśli nie jest odpowiednio umyty.)
   3. Dodać lamininę rozcieńczoną w PBS do stężenia 10 μg/ml do płytek pokrytych PLO. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, najlepiej przez noc. Po inkubacji odessać roztwór lamininy bez spłukiwania, aby zwiększyć adhezję komórek.
      nuta: Płytki można wcześniej pokryć PLO, trzykrotnie umyć wodą, wysuszyć w sterylnym kapturze i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Rozmrozić jedną fiolkę NPC zawierającą 6 x 10⁶ komórek/fiolkę na każdą 10 cm płytkę do hodowli komórek.
3. Wyjmij krioprobówkę NPC z ciekłego azotu i natychmiast umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na maksymalnie 2 minuty. Szybko rozmrozić, potrząsając fiolką, aż pojawi się mały kawałek lodu otoczony płynem.
4. Przenieś agregacje komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety 1000 μl i dodaj do 15 ml wstępnie podgrzanej pożywki do różnicowania neuronalnego (NDM) lub zmodyfikowanego podłoża Eagles (DMEM) firmy Dulbecco / suplementu F21 F12 firmy Ham w celu rozcieńczenia dimetylosulfotlenku (DMSO).
5. Wirować przy 300 x g przez 5 min.
6. Odessać supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą pożywki różnicującej neuronu ruchowego (MN) (Tabela 1) + ROCK-I (20 μM) i za pomocą pipety o pojemności 1000 μl przeprowadzić tarturację w górę iw dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki (do 5 razy).
7. Przenieść zawiesinę jednokomórkową na płytkę pokrytą PLO-Laminin o średnicy 10 cm.
8. Przenieś płytkę do inkubatora i pozostaw ją w spokoju na noc, aby umożliwić prawidłowe przyleganie komórek

2. Różnicowanie NPC rdzenia kręgowego na neurony ruchowe

1. Wykonaj początkowe kroki, jak wspomniano w krokach 1.1-1.8, przy czym końcowym podłożem jest ośrodek różnicujący MN + ROCK-I (20 μM).
2. Dzień po posiewie należy przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki na pożywkę różnicującą MN bez ROCK-I, a następnie zmieniać pożywkę co drugi dzień. W weekend nakarm komórki w piątek, a następnie ponownie w poniedziałek. W razie potrzeby przepłucz komórki PBS, aby usunąć resztki komórek.
3. Zmień pożywkę za pomocą pożywki różnicującej MN + arabinozydu cytozyny (ARA-C) (0,02 μM) i inkubuj przez 48 godzin, gdy komórki progenitorowe zaangażowane glejowo wyłaniają się jako pojedyncze proliferujące płaskie komórki pod postmitotycznym progenitorem MN zagregowanym w skupiska komórek.
   nuta: Zwykle dzieje się to w ciągu pierwszych 7 dni po początkowym posiewie, chociaż może wystąpić zmienność w zależności od linii komórkowej.
4. Po 48 godzinach odessać pożywkę zawierającą ARA-C, delikatnie przepłukać kultury trzykrotnie PBS i zmienić pożywkę na świeżą pożywkę MN bez ARA-C.
5. Po leczeniu ARA-C należy wykonywać wymianę pożywki co drugi dzień (lub w poniedziałek, środę i piątek), usuwając starą pożywkę za pomocą ręcznej pipety, a nie aspiratora próżniowego, aby zapobiec przedwczesnemu oderwaniu się klastrów neuronalnych. Ponadto raz w tygodniu należy wzbogacić pożywkę MN o Lamininę w dawce 1 μg/ml, aby jeszcze bardziej zwiększyć przywiązanie neuronów do płytek hodowlanych.

Tabela 1: Pożywki hodowlane

Średnia nazwa	Odczynniki	Stężenia
Ośrodek różnicowania neuronalnego (NDM)	Neurobasal L-glutamina Aminokwasy endogenne Suplement N - N2 Suplement Penicylina/streptomycyna	1x 100x 100x 100x 100x
Ośrodek różnicowania neuronów ruchowych	Podłoże różnicowania neuronalnego Kwas askorbinowy Puromorphamine Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego Rzęskowy czynnik neurotroficzny Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 Czynnik neurotroficzny pochodzący z linii komórek glejowych Kwas retinowy Związek E Suplement B - B27 Suplement	1x 0,4 μg/ml 1 μM 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 10 ng/ml 1 μM 125 nM 50-krotnie

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sterylne płytki hodowlane 10 cm	sokół	353003
Aminokwasy endogenne (NEAA)	Rybak termiczny	11140050	Koncentracja robocza 100x
Suplement N - Suplement N2	Rybak termiczny	17502048	Koncentracja robocza 100x
L-glutamina	Rybak termiczny	Numer katalogowy 25030	Koncentracja robocza 100x
Neuropodstawowy	Rybak termiczny	21103049	Koncentracja robocza 1x
Kwas retinowy (RZS)	Sigma	Czynnik R2625	Rozpuścić 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotnić zapas 100 μl/probówkę i zamrozić w temperaturze -80 °C. Weź 200 μl 100 mM zapasu i rozcieńcz 10x (dodaj 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Podwielokrotność 50 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10000 do użycia. (stężenie robocze 2 μM).
Poliornityna (PLO)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3655	Rozpuścić 100 mg w 1 ml ddW, aby otrzymać 100 mg/ml roztworu podstawowego. Porcjować zapas w probówkach o pojemności 100 μl. (stężenie robocze 100 μg/mL)
Laminina	Rybak termiczny	23017-015	Roztwór podstawowy 1 mg/ml, stężenie robocze 10 μg/ml (powłoka), 1 μg/ml (pożywka komórkowa)
Kwas askorbinowy (ASAC)	Sigma	Nr kat. A4403	Rozpuść 100 mg w 250 ml dH2O, aby uzyskać 0,4 mg/ml zapasu. Sterylny filtr przepuścić przez filtr 0,22 μm, podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 ºC. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 0,4 μg/ml).
Rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)	Peprotech	450-13	Rozpuść 100 μg w 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodaj 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Związek E	Księga Abcam	ab142164	Rozpuść 250 μg w 2,0387 ml DMSO, aby uzyskać zapas 250 μM. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 125 nM).
DMEM/F12	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 113300	Koncentracja robocza 1x
Neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)	Peprotech	450-10	Rozpuścić 100 μg w 1 ml PBS do 100 μg/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Inhibitor ROCK-I	Peprotech	1293823	Rozpuścić 5 mg w 1480 μl dH2O do uzyskania 10 mM zapasu, podwielokrotności i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:500 do użycia. (stężenie robocze 20 μM).
Ołówek/Streptomycyna	Rybak termiczny	15140122	Koncentracja robocza 100x
Purmorfamina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Rozpuścić 5 mg w 9,6 ml DMSO, aby uzyskać 1 mM roztwór. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć do użycia w stosunku 1:1000. (stężenie robocze 1 μM).
Rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego (BDNF)	Peprotech	Rozdział 450-02	Odwirować na krótko przed rozpuszczeniem. Rozpuścić 100 μg w 1 ml PBS do 100 μg/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Insulinopodobny czynnik wzrostu 1 (IGF-1)	Systemy badawczo-rozwojowe	291-G1-200	Rozpuścić 200 μg w 2 ml PBS do 100 μg/ml, następnie dodać 18 ml 0,1% BSA-PBS, aby uzyskać 10 μg/ml bulionu i przechowywać w temperaturze -80 ºC. Podwielokrotność i zamrozić w temperaturze -80 ºC. Rozcieńczyć 10 μg/ml bulionu w stosunku 1: 1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Neurotroficzny pochodzenia komórek glejowych (GDNF)	Peprotech	450-10	Rozpuścić 100 μg w 1 ml PBS do 100 μg/ml, a następnie dodać 9 ml sterylnego 0,1% BSA-PBS do 10 μg/ml. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:1000 do użycia. (stężenie robocze 10 ng/ml).
Kwas retinowy (RZS)	Sigma	Czynnik R2625	Rozpuścić 100 mg w 3,3 ml DMSO, aby uzyskać 100 mM roztworu podstawowego. Podwielokrotnić zapas 100 μl/probówkę i zamrozić w temperaturze -80 °C. Weź 200 μl 100 mM zapasu i rozcieńcz 10x (dodaj 1,8 ml DMSO), aby uzyskać 10 mM zapasu. Podwielokrotność 50 μl/probówkę i przechowywać w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:10000 do użycia. (stężenie robocze 2 μM).
Związek E	Księga Abcam	ab142164	Rozpuść 250 μg w 2,0387 ml DMSO, aby uzyskać zapas 250 μM. Podwielokrotność porcji i zamrozić w temperaturze -80 °C. Rozcieńczyć w stosunku 1:2000 do użycia. (stężenie robocze 125 nM).
Suplement B - B27 Suplement	Rybak termiczny	21985023	Stężenie robocze 50x
Sterylne kaptury do hodowli komórkowych	Firma piekarska	Zobacz materiał SG-600
Wirówka do hodowli komórkowych na stole	Rybak termiczny	75004261	Legenda Sorvalla X1R
Kąpiel wodna	Rybak termiczny	2332	Izotemp
Kontrolowana wilgotność Inkubator do hodowli komórkowych	Rybak termiczny	Okręg wyborczy 370	ustawione na 37 ºC, 5 % CO2

TGL powiedział: Rozdział powiedział: szt. TGL szt. powiedział: TGL TGL