Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Streszczenie

Źródło: Bovio, P., et al., Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znaku dimetylacji histonu 3 lizyny 79. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowania

1. Preparaty do izolacji CGNP (progenitor neuronu ziarnistego móżdżku)
   1. Zorganizuj odpowiednie krycie myszy, aby wygenerować zwierzęta P5-P7 w celu wyizolowania móżdżku (3-5 zwierząt na ChIP i warunek).
   2. Przygotować HBSS/glukozę, dodając 6 mg/ml glukozy do buforu HBSS.
   3. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowych CGNP (CGM), dodając do DMEM-F12 1 % (v/v) suplementu N2, 1 % (v/v) penicyliny-streptomycyny-neomycyny, 25 mM KCl i 10 % FCS. Do uprawy CGNP należy przygotować pożywkę CGM bez FCS, ale zawierającą 0,6 μg/ml sonic hedgehog (SHH) (CGM-SHH) i w razie potrzeby zrównoważyć ją do 37 °C.
   4. Pokryj 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych 100 μg/ml poli-D-lizyny przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej w celu usunięcia komórek glejowych. Następnie umyć dwukrotnie sterylnym ddH₂O i pozostawić płytki do wyschnięcia. Płytki należy przechowywać maksymalnie przez tydzień w temperaturze 4 °C.
   5. W przypadku hodowli CGNP należy pokryć 6-dołkowe płytki hodowli komórkowej poli-L-ornityną (0,1 mg/ml) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnie przemyć dwukrotnie_H2Odo hodowli komórkowej i pozostawić płytki do wyschnięcia.
      nuta: Płytki można przechowywać maksymalnie przez tydzień w temperaturze 4 °C.
   6. Przygotować 0,025 % trypsyny (w/v) w HBSS/glukozie i w razie potrzeby zrównoważyć ją do 37 °C.
2. Izolacja neuronalnego progenitora tkanki mózgowej
   1. Izolacja i opcjonalna hodowla CGNP (progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku)
      1. Eutanazja zwierząt P5-7 przez ścięcie głowy za pomocą nożyczek. Usuń skórę głowy, otwórz czaszkę i usuń mózg za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Odizoluj móżdżek i przenieś go do lodowatego HBSS/Glukoza. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne i przenieś móżdżek do 15 ml probówek wypełnionych zimnym HBSS/Glukozą.
      2. Przemyć móżdżek trzykrotnie 10 ml lodowatego HBSS/glukozy (zebrać je przez odwirowanie w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), a następnie homogenizować móżdżek, delikatnie pipetując w górę i w dół pipetą o pojemności 1 ml (maksymalnie 2-3 razy), aby uzyskać 0,5-1 mm³ fragmenty.
      3. Dodać 5 ml 0,025% trypsyny do HBSS/glukozy i inkubować tkankę pod ciągłym mieszaniem w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut. Zatrzymać trawienie przez dodanie 5 ml CGM i zebrać tkankę przez odwirowanie w temperaturze 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
      4. Usunąć supernatant i rozprowadzić tkankę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml w 1 ml CGM i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 15 ml.
         nuta: Ważne jest, aby unikać pęcherzyków powietrza.
         1. Dodać 5 ml CGM i inkubować mieszaninę przez 2 minuty na lodzie, aby osadzić resztki tkanek. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 2 ml CGM do pozostałej tkanki i powtórz procedurę rozcierania.
      5. Zebrać supernatanty (bez resztek tkanek, łącznie około 10 ml) i odwirować przy 650 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania komórek móżdżku. Zawiesić osad w 10 ml CGM.
      6. Ponieważ astrocyty szybciej i silniej przylegają do poli-D-lizyny niż CGNP, umieść komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną o stężeniu 100 μg/ml (do 4 ml na dołek) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 °C w celu usunięcia astrocytów.
      7. Wstrząsnąć płytką i zebrać supernatant. Następnie odwirować w probówce o pojemności 15 ml przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml CGM i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.
         nuta: CGNP są okrągłe, małe i pokazują aureolę, gdy są obrazowane za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym.
      8. W razie potrzeby wysiać komórki w 37 °C, wstępnie ogrzanym CGM na płytkach pokrytych poli-L-ornityną (3 x 10 6 komórek na 6 dołków) i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i wilgotności względnej 100%.
         nuta: Pozostawienie CGM na płytkach (a wraz z tym FBS) spowoduje różnicowanie CGNP w neurony ziarniste móżdżku (CGN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement B27 (50x)	Technologie życiowe	17504044	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CCM
Zobacz materiał DMEM-F12	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 11320-033	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CGM
Surowica bydlęca płodu 10% (v/v)	Gibco (firma Gibco)	10082147	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do izolacji CPC i CGM
glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G5767	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do izolacji CGNP
Glutation (1,25 mg/ml)	Sigma-Aldrich	Klasa G4251	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CCM
glicyna	Carla Rotha	Numer katalogowy: 3187	Kategoria: ChIP Skrót/komentarz: Do utrwalania komórek
Zbilansowany roztwór soli Hanka	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 14025-100	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: HBSS
L-glutamina (200 mM)	Technologie życiowe	25030081	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CCM
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do hodowli CPC
Suplement N2	Technologie życiowe	17502048	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CGM
Podłoże nerwowo-podstawowe	Gibco (firma Gibco)	21103049	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CCM
Penicylina-Streptomycyna-Neomycyna 1% (v/v)	Technologie życiowe	15640055	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: PSN, dla CCM i CGM
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe	10010023	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: PBS, dla izolacji CPC
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6407	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do izolacji CGNP
Bromowodorek poli-L-ornityny	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P3655	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do hodowli CPC
Chlorek potasu	Rybak termiczny	AM9640G	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: KCl, dla CGM
Skok soniczny (SHH)	Sigma-Aldrich	SRP6004	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do izolacji CGNP
Dysmutaza ponadtlenkowa (1mg/ml)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7571	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Dla CCM
Trypsyna-EDTA 0,05% (w/v)	Sigma Aldrich	59417C	Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/komentarz: Do izolacji CPC

powiedział: