Generowanie sferoid z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Shaker, M. R., et al. Solidna i wysoce odtwarzalna generacja organoidów korowych mózgu do modelowania starzenia się neuronów mózgu in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje transformację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w sferyczne organoidy mózgu. Stosując specyficzne inhibitory, hPSC są kierowane do różnicowania się w kierunku linii neuronalnej, tworząc kolonie neuroektodermalne. Następnie wprowadzane są specjalne czynniki wzrostu, które sprzyjają samoorganizacji i proliferacji kolonii, co ostatecznie prowadzi do powstania sferycznych organoidów mózgowych.

Protokół

>1. Generowanie organoidów korowych w mózgu (Rysunek 1)

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w tej sekcji protokołu będą miały miejsce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2, chyba że zaznaczono inaczej.

1. Indukcja kolonii neuroektodermalnych 2D z hodowli 2D ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) (dni od -1 do 3)
   1. Przed indukcją umieść kolonie hPSC na macierzy błony podstawnej zakwalifikowanej do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) na 6-dołkowej płytce o gęstości 20%-30%. Osiągnij tę gęstość poprzez pasażowanie kolonii hPSC z jednego....

Wyniki

Rysunek 1: Schemat ideowy do generowania odtwarzalnych organoidów korowych mózgu. Schematyczny przebieg procedury eksperymentalnej generowania organoidów korowych mózgu z hPSC utrzymywanych w pożywce bezpodajnikowej. Przepływ pracy zawiera przegląd sześciu kroków związanych z różnicowaniem hPSC 2D w tkanki ludzkie z wzorami korowymi 3D w organoidach.

....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16% formaldehydu (w/v) Nie zawiera metanolu	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 28908	4% PFA rozcieńcza się w 1x PBS
2-merkaptoetanol 50 ml (1000x)	Technologie życiowe Australia (TFS)	21985023	Stosowany w mediach NM i DM
B 27 Suplement 10 ml	Technologie życiowe Australia (TFS)	17504044	Stosowany w mediach NM i DM
Mikroskop CKX53 z kamerą SC50	Olympus
Corning Costar 6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Sigma Aldrich Sp. z o.o	CLS3516-50EA
Proszek Dispase II	Thermo Fisher Naukowy	17105041	Proszek rozpuszcza się w HBSS, filtruje przez filtr 0,22 μm, porcjuje w 10 ml i przechowuje w temperaturze -20 °C
DMEM Mieszanka odżywcza F12 10x 500 ml (DMEM/F-12)	Rybak termiczny	11320082	Stosowany w mediach NM i DM
DMSO Dimetylosulfotlenek	Sigma Aldrich Sp. z o.o	D2650-100ML
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Sigma Aldrich Sp. z o.o	D1408-500ML
Falcon Matrigel z kwalifikacją hESC Matrix	In Vitro Technologies Pty Sp. z o.o	FAL354277	Sporządzić porcje po 100 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C
Suplement GlutaMAX 100x	Thermo Fisher Naukowy	35050061	Stosowany w mediach NM i DM
Hanks Zrównoważony roztwór soli	Sigma Aldrich Sp. z o.o	Zobacz materiał H8264
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (UE79)			Reporogram wykonany we własnym zakresie z fibroblastów skóry
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (G22)	Biokomórki genowe		Otrzymany z Genea Biocells (San Diego, Stany Zjednoczone)
Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (WTC)			Prezent od profesora Bruce'a Conklina
Inhibitor kinazy RI TGF-Β w roztworze VI, SB431542	Merck	US1616464-5MG
Roztwór insuliny rekombinowany ludzki	Sigma Aldrich Sp. z o.o	I9278	Stosowany w mediach NM i DM
LDN193189 Dichlorowodorek	Sigma Aldrich Sp. z o.o	SML0559-5MG	Używany podczas różnicowania
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x)	Thermo Fisher Naukowy	11140050	Stosowany w mediach NM i DM
mTeSR Plus	TECHNOLOGIE KOMÓREK MACIERZYSTYCH	Numer katalogowy: 100-0276	Służy do utrzymywania kolonii hiPSC przed różnicowaniem za pomocą pożywek NM
Suplement N2 5 ml (100x)	Life Technologies Australia Sp. z o.o	17502048	Stosowany w mediach NM i DM
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Naukowy	15140122	Stosowany w mediach NM i DM
Rekombinowany ludzki FGF podstawowy	Systemy badawczo-rozwojowe	233-FB-01M	Podwielokrotności wytwarza się w temperaturze 20 μg/ml i przechowuje w temperaturze -20 °C
SB431542	Tocris powiedział:	Rok 1614	Używany podczas różnicowania
Płytki wielodołkowe o bardzo niskim mocowaniu, płytki 24-dołkowe, polistyren	Sigma Aldrich Sp. z o.o	CLS3473-24EA

. . . . . . powiedział: . . .