>1. Generowanie organoidów korowych w mózgu (Rysunek 1)
UWAGA: Wszystkie kroki opisane w tej sekcji protokołu będą miały miejsce w kapturze bezpieczeństwa biologicznego klasy 2, chyba że zaznaczono inaczej.
- Indukcja kolonii neuroektodermalnych 2D z hodowli 2D ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) (dni od -1 do 3)
- Przed indukcją umieść kolonie hPSC na macierzy błony podstawnej zakwalifikowanej do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) na 6-dołkowej płytce o gęstości 20%-30%. Osiągnij tę gęstość poprzez pasażowanie kolonii hPSC z jednego dołka płytki 6-dołkowej przy 60% konfluencji do trzech dołków płytki 6-dołkowej.
- W przypadku powlekania matrycy membrany podstawnej należy rozcieńczyć matrycę błony podstawnej w stosunku 1:50 w zwykłym podłożu podstawowym. Równomiernie umieścić 1 ml / dołek na płytce 6-dołkowej, inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT), a następnie aspirować.
- Utrzymuj kolonie hPSC przez 1 dzień w 2 ml pożywki do hodowli komórek bez surowicy przed różnicowaniem.
- W dniu różnicowania hPSC należy sprawdzić kolonie hPSC za pomocą mikroskopii jasnego pola przy powiększeniu od 4 do 10 razy, aby upewnić się, że kolonie są zdrowe bez wykrywalnego różnicowania.
nuta: Zdrowe hPSC będą tworzyć ciasne kolonie krawędziowe z komórkami, które mają duże jądro, bardzo małą cytoplazmę i wydatne jąderka. Zróżnicowane kolonie iPSC będą wykazywać wyraźne różnice morfologiczne w stosunku do opisanych powyżej kolonii hPSC, szczególnie wokół zewnętrznych krawędzi kolonii lub w środku.
- Dodać odczynniki wymienione w tabeli 1 w celu uzupełnienia pożywki N2 wymaganej do różnicowania. Przynieś to podłoże do RT przed użyciem.
- Po osiągnięciu temperatury rzeczywistej należy odessać pożywkę do hodowli komórkowych bez surowicy z każdej studzienki płytki 6-dołkowej i zastąpić ją 2 ml pożywki N2 delikatnie dodanej za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml.
- Dodać podwójny supresor matek przeciwko inhibitorom dekapentaplegii (SMAD), SB-431542 (10 μM) i LDN 193189 (100 nM).
nuta: Inhibitory SMAD można dodawać do pożywki N2 po umieszczeniu pożywki w każdym dołku lub do wymaganej ilości pożywki N2 przed wymianą pożywki do hodowli komórkowych bez surowicy. Inhibitory mogą być równomiernie wprowadzane do pożywki poprzez delikatne obracanie płytki lub odwrócenie rurki zawierającej pożywkę i inhibitory 3-4 razy.
- Dodawaj świeże pożywki N2 uzupełnione SB-431542 (10 μM) i LDN 193189 (100 nM) codziennie do każdego dołka przez następne 2 dni.
nuta: Świeże podłoże N2 dodaje się w celu zmniejszenia długotrwałego narażenia komórek na dimetylosulfotlenek (DMSO), który jest używany do rozpuszczania związków SB-431542 i LDN 193189 i zapobiegania cytotoksyczności.
- Generowanie sferoid neuroektodermalnych 3D z indukowanych kolonii neuroektodermalnych 2D (dni od 3 do 7)
- Podnieś indukowane kolonie neuroektodermalne za pomocą dypazy, wykonując kroki 1.2.2-1.2.8.
- Najpierw wyjmij 2 ml pożywki N2 z płytki 6-dołkowej i przemyj 1x HBSS, aby upewnić się, że cała pożywka N2 została usunięta.
nuta: Pożywka N2 może zakłócać aktywność enzymatyczną dypazy, uniemożliwiając odpowiednie oderwanie kolonii neuroektodermalnych od studni.
- Dodaj 1 ml 2,4 jednostki/ml dypazy do każdej studzienki zawierającej kolonię.
- Inkubować studzienkę przez 20-25 minut (maksymalnie 30 minut) w temperaturze 37 °C. Regularnie sprawdzać, czy kolonia nie została oderwana.
nuta: Małe kolonie mogą oderwać się w ciągu 20 minut. Wszelkie kolonie, które utknęły po 30 minutach, należy zignorować.
- Po inkubacji dodać 1 ml pożywki N2 do studzienki, aby zatrzymać aktywność enzymu dyspazy i przenieść kolonie do probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki do pipety P1000 o szerokim otworze lub zmodyfikowanej końcówki do pipety P1000 wyciętej sterylnymi nożyczkami (dzięki czemu jest to końcówka P1000 o szerokim otworze).
- Pozwól, aby grudki kolonii opadły na dno rurki z grawitacją.
nuta: Ten proces zajmie około 1 minuty.
- Gdy grudki opadną, ostrożnie usuń supernatant za pomocą standardowej końcówki pipety P1000 i zastąp go 1 ml świeżej pożywki N2. Powtórz ten krok prania trzy razy, aby zapewnić całkowite usunięcie dispase.
nuta: Pozostała dypaza zapobiegnie równomiernemu tworzeniu się sferoid neuroektodermalnych i wywoła śmierć komórki.
- Po umyciu ponownie zawiesić grudki komórek w 3 ml pożywki N2, przenieść do jednego dołka płytki 6-dołkowej i dodać 40 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
nuta: Jeśli duża liczba kolonii neuroektodermalnych zostanie odłączona, kolonie te można posiać na dwóch lub więcej dołkach 6-dołkowej płytki, aby zapobiec fuzji sferoid. Po 24 godzinach od odłączenia kolonii należy sprawdzić, czy uformowały się sferoidy.
- Utrzymuj sferoidy w tym samym podłożu przez następne 3-4 dni, ale codziennie dodawaj świeży bFGF (40 ng / ml) do każdej studzienki, aby promować proliferację komórek neuroektodermalnych, samoorganizację oraz indukować i rozszerzać neuroepitelia.
nuta: Jeśli sferoidy zostały posiane z większą gęstością, podłoże prawdopodobnie zmieni kolor na żółty i będzie wymagało wymiany co 2 dni na świeży bFGF (40 ng / ml). Nie jest to jednak zalecane, a zamiast tego w każdej studzience należy utrzymywać mniejszą liczbę sferoid, aby uniknąć tego problemu. Sferoidy mogą zostać osadzone w macierzy błony podstawnej po 3 dniach, jeśli widoczne są neuroepitelie. Jeśli nabłonek nerwowy nie jest widoczny lub nie wygląda na silny, utrzymuj sferoidy przez kolejny dzień i sprawdź ponownie.
Tabela 1: N2 Średni. W tabeli wymieniono odczynniki wymagane do przygotowania pożywki N2.
| Komponenty multimedialne | koncentracja |
| DMEM Mieszanka odżywcza F12 10x 500 ml (DMEM/F-12) | |
| Suplement N2 5 ml (100x) | Zasilany w 1% |
| B 27 Suplement 10 ml | Suplementowany w dawce 2% |
| Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x) | Suplementowany w dawce 1% |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Suplementowany w dawce 1% |
| 2-merkaptoetanol 50 mL(1000x) | Uzupełniony w 0,1% |
