$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie materiału preparacyjnego, pożywek hodowlanych, urządzeń mikroprzepływowych
- Autoklaw kleszczy i nożyczek do mikropreparacji (121 °C, czas sterylizacji: 20 min) i przechowuj je w sterylnym pojemniku.
- Wysterylizować szklane szkiełka nakrywkowe (24 mm x 24 mm) poprzez inkubację w 1 M HCl przez 24 godziny na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37 °C. Przemyć je trzykrotnie sterylnym, destylowanymH2Oi trzykrotnie etanolem 99%. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe w temperaturze 37 °C lub pod sterylnym kapturem przepływowym. Na koniec przeprowadź autoklaw lub wystaw szkiełka nakrywkowe na działanie światła UV (30 min), aby zakończyć sterylizację. Szkiełka nakrywkowe można następnie przechowywać w etanolu 70%.
- Za pomocą sterylnych kleszczyków ostrożnie wyjmij urządzenia AXIS Axon Isolation Devices z opakowania i umieść je na sterylnej szalce Petriego.
- Za pomocą sterylnego stempla do biopsji (ø: 1 mm) należy wykonać jeden otwór na próbkę do hodowli (ryc. 1) w korespondencji komór hodowlanych.
nuta: Nie przebijaj zbyt blisko mikrorowków, ponieważ mogą one zostać uszkodzone przez zastosowany nacisk.
- Wysterylizuj urządzenia izolacyjne AXIS Axon, zanurzając je w etanolu 70%. Następnie należy całkowicie wysuszyć urządzenia izolacyjne AXIS Axon i szkiełka nakrywkowe pod sterylnym kapturem przepływowym. Odczekaj co najmniej 3 godziny przed kontynuowaniem.
nuta: Niepełne wysuszenie spowoduje wadliwy montaż urządzeń mikroprzepływowych.
- Umieścić każde szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o średnicy 35 mm lub w studzience na płytce 6-dołkowej.
- Umieść urządzenie AXIS Axon Isolation Device na szkiełku nakrywkowym i delikatnie, ale mocno dociśnij kleszkami z zagiętymi końcami, aby zapewnić pełną przyczepność między urządzeniem izolacyjnym a szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
- W każdej komorze hodowlanej odpipetować 150 μl poli-D-lizyny (0,1 mg/ml w sterylnym, destylowanymH2O). Umieść urządzenia mikroprzepływowe pod próżnią na 5 minut, aby usunąć całe powietrze z komór hodowlanych.
- Jeśli w komorach nadal widać powietrze, należy ponownie odpipetować roztwór poli-D-lizyny do komór.
- Inkubować urządzenia z poli-D-lizyną O/N w temperaturze 37 °C.
- Umyć komory trzykrotnie sterylnym, destylowanymH2O.
- Napełnić komory 150 μl roztworu roboczego lamininy (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) lub pożywce bez surowicy) i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.
- Przygotować 50 ml pożywki do hodowli zwojów nerwu trójdzielnego o następującym składzie: 48 ml pożywki neurobazalnej, 1 ml B-27, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 5 ng/ml czynnika wzrostu nerwów (NGF), 0,25 pM arabinozydu cytozyny.
- Przygotować 50 ml pożywki do hodowli zarodków zębów o następującym składzie: 40 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, stężenie końcowe: 20%), 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 150 μg/ml kwasu askorbinowego.
2. Wytwarzanie i sekcja embrionów myszy
- Określ wiek zarodka na podstawie czopa pochwowego (czop pochwowy: dzień rozwoju zarodka 0,5, E0,5) i potwierdź go za pomocą kryteriów morfologicznych. W tym protokole zazwyczaj używamy zarodków myszy E14.5-E17.5.
- Oczyść obszar sekcji i stereoskop etanolem 70%.
- Złożyć w ofierze ciężarną matkę przez zwichnięcie szyjki macicy. Umieść szyję myszy między pierwszym a drugim palcem na siatce i zdecydowanie pociągnij ogon.
- Wypreparuj skórę wokół dolnej części brzucha i otwórz brzuch za pomocą nożyczek. Zlokalizuj macicę: w późnych stadiach ciąży macica obficie wypełnia jamę brzuszną.
- Wypreparuj macicę i umieść ją w probówce wypełnionej PBS na lodzie. Na lodzie tkankę można pozostawić na kilka godzin. Wyrzuć zwłoki matki zgodnie z wytycznymi instytucji.
- Wypreparuj zarodki z macicy i uwolnij je od tkanek pozazarodkowych. Umieścić zarodki w PBS na lodzie.
- Odetnij głowę zarodkom za pomocą nożyczek i oddziel dolną szczękę od reszty głowy za pomocą nożyczek do mikropreparacji (ryc. 2A). Usuń dolną szczękę precyzyjnie, nie uszkadzając zwojów nerwu trójdzielnego; Ponieważ te ostatnie są zlokalizowane w bliskiej odległości od żuchwy, możliwe jest ich przypadkowe uszkodzenie. Zachowaj dolną szczękę i resztę głowy w zimnym PBS, na lodzie.
- Aby wypreparować zwoje nerwu trójdzielnego (TG), weź głowę i umieść ją na szklanej szalce Petriego, uprzednio wypełnionej zimnym PBS. Za pomocą kleszczy usuń skórę i czaszkę. Następnie usuń kresomózgowie i móżdżek, umieszczając kleszcze poniżej kresomózgowia i podnieś; Kresomózgowie i móżdżek odwrócą się razem, pozostawiając odsłonięte dno czaszki.
- Zlokalizuj zwoje nerwu trójdzielnego (ryc. 2B). Użyj kleszczy, aby oddzielić TG od nerwów trójdzielnych. Wyeliminuj resztki wypustek nerwu trójdzielnego za pomocą igieł preparacyjnych jako noży. Umieść wypreparowane TG na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.
- Aby wypreparować zęby embrionalne, należy umieścić dolną szczękę, uprzednio oddzieloną od czaszki, na szklanej szalce Petriego, wypełnionej zimnym PBS. Używając igieł preparacyjnych jako noży, usuń język i skórę otaczającą szczękę. Oddziel lewą i prawą półszczękę, przecinając wzdłuż linii środkowej szczęki. Zarodki zębów są łatwo widoczne, jak pokazano na rysunku 2C. Odizoluj zarodki zębów za pomocą igieł do preparowania i usuń nadmiar tkanek niezwiązanych z zębem. Umieść wypreparowane zarodki zębów na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS i trzymaj je na lodzie.
3. Mikroprzepływowe kokultury
- Po rozbiorze usuń lamininę z urządzeń mikroprzepływowych. Napełnij komory 200 μl odpowiedniego podłoża.
- Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś wypreparowane TG i zarodki zębów do otworów utworzonych przez dziurkowanie (ryc. 2D). Upewnij się, że zarodki zębów nie unoszą się na wodzie i toną, dopóki nie zetkną się ze szkiełkami nakrywkowymi.
- Wyhodować próbki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Zmieniaj pożywkę co 48 godzin. Nie opróżniaj całkowicie komór i nie pipetuj bezpośrednio do komór hodowlanych.
Całkowite opróżnienie komór spowodowałoby powstanie pęcherzyków powietrza w komorach; Bezpośrednie pipetowanie do komory spowodowałoby uszkodzenie aksonów. Aby uniknąć tych problemów, usuń pożywkę, kierując pipetę w stronę zewnętrznej strony studzienek; Podobnie, odpipetować świeżą pożywkę po stronie studzienek znajdujących się naprzeciwko komór.
- Kokultury można łatwo zobrazować za pomocą mikroskopii poklatkowej w okresie hodowli i można je utrzymywać przez ponad 10 dni.
- Po okresie hodowli umyć komory, pipetując 150 μl PBS do jednego dołka na komorę i pozwalając PBS przepływać przez komory trzy razy.
- Usunąć PBS i utrwalić próbki, pipetując 150 μl paraformaldehydu 4% (w PBS) do jednego dołka na komorę; inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Przemyć komory dwukrotnie PBS, jak opisano w ppkt 3.6.
- Kontynuuj dalszą analizę.
