$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
UWAGA: Rysunek 1A, B pokazuje schemat wstępnie zmontowanego układu COC z cyklicznego kopolimeru olefiny, w tym lokalizacje głównych kanałów lub komór, studzienek i mikrorowków. Podzielony na przedziały chip może tworzyć wyraźne płynne mikrośrodowiska w komorze, jak wykazano przez izolację barwnika barwiącego żywność (ryc. 1C).
1. Powlekanie wielokomorowych układów scalonych dla neuronów hSC
UWAGA: Rysunek 2A pokazuje przegląd procedur powlekania.
- Rozpuścić poli-L-ornitynę w wodzie destylowanej do hodowli komórkowych, aby uzyskać 600 μl roztworu na wiór roztworu roboczego o stężeniu 20 μg/ml.
- Odessać pozostałą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) pozostałą po przygotowaniu wiórów ze studzienek. Podczas zasysania należy upewnić się, że końcówka pipety znajduje się z dala od otworu kanału.
nuta: Kanały mikroprzepływowe muszą pozostać wypełnione przez cały czas trwania tej procedury. Nie zasysaj cieczy z kanałów/komór, tylko ze studzienek.
- Załaduj 150 μl roztworu roboczego poli-L-ornityny do prawego górnego dołka. Odczekaj 90 sekund lub do momentu, gdy płyn zacznie wypełniać dolną prawą dolną studnię. Dodaj 150 μl pożywki do prawego dolnego dołka i odczekaj 5 minut, aby płyn przeszedł przez mikrorowki.
- Dodaj 150 μl pożywki do lewego górnego dołka. Odczekaj 90 s, a następnie dodaj 150 μl do lewego dolnego dołka. Owinąć uchwyt wióra (wiórów) folią parafilmową i umieścić w temperaturze 4 °C na noc.
nuta: Alternatywnie można umieścić chip i uchwyt w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
- Zassać pożywkę ze studzienek, upewniając się, że końcówka pipety jest umieszczona z dala od otworu kanału. Dodaj 150 μl sterylnej wody do prawego górnego dołka. Odczekaj 90 sekund, a następnie dodaj 150 μl do prawego dolnego dołka. Odczekaj 5 minut, aby płyn przeszedł przez mikrorowki.
- Dodaj 150 μl sterylnej wody do lewego górnego dołka, odczekaj 90 s, a następnie dodaj kolejne 150 μl do lewego dolnego dołka.
- Powtórz kroki 1.5-1.6.
- Powoli rozmrażać lamininę w temperaturze od 2 °C do 8 °C i przygotować roztwór roboczy o stężeniu 10 μg/ml.
- Załaduj 150 μl roztworu roboczego lamininy do prawego górnego dołka. Odczekaj 90 sekund lub do momentu, gdy płyn zacznie wypełniać dolną prawą dolną studnię. Odpipetować 150 μl do prawego dolnego dołka. Odczekaj 5 minut, aby laminina przeszła przez mikrorowki.
- Dodaj 150 μl lamininy do lewego górnego dołka. Odczekaj 90 s, a następnie dodaj 150 μl do lewego dolnego dołka. Inkubować wiór w uchwycie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Wypłucz chip PBS (bez Ca2+ i Mg2+). Załaduj 150 μl PBS do prawego górnego dołka. Odczekaj 90 sekund lub do momentu, gdy płyn zacznie wypełniać dolną prawą dolną studnię. Dodaj 150 μl PBS do prawego dolnego dołka i odczekaj 5 minut, aby PBS przeszedł przez mikrorowki.
- Odpipetować 150 μl PBS do lewego górnego dołka. Po 90 s odpipetować 150 μl do lewego dolnego dołka.
- Odessać PBS z chipa, a następnie przepłukać chip pożywką NSC (patrz Tabela materiałów). Załaduj 150 μl pożywki do prawego górnego dołka. Po 90 s lub gdy ciecz przejdzie przez prawy kanał do prawego dolnego dołka, dodaj 150 μl do prawego dolnego dołka. Odczekaj 5 minut, aby media przepłynęły przez mikrorowki.
- Dodaj 150 μl pożywki do lewego górnego dołka i kolejne 150 μl do lewego dolnego dołka. Inkubować chip w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu wstępnego przygotowania chipa do momentu, gdy będzie gotowy do wysiewu NSC.
nuta: W razie potrzeby frytki można wstępnie kondycjonować przez noc.
2. Umieszczanie NSC w chipie wielokomorowym
UWAGA: Ten protokół wykorzystywał komercyjnie zakupione NSC, w przeciwieństwie do naszej poprzedniej publikacji, która zaczynała się od ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. W tym protokole nerwowe komórki macierzyste są umieszczane bezpośrednio w plastikowych chipach, gdzie różnicują się w neurony. Komórkom można pozwolić na namnażanie się jako NSC (bez różnicowania) przez maksymalnie 2 pasaże i przechowywać w fiolkach w płynnym N2 do dalszego wykorzystania. W protokole tym wykorzystuje się fiolki NSC przechowywane w cieczyN2 po przejściu 1 lub 2. Rysunek 2B przedstawia przegląd procedur powlekania.
- Rozmrozić NSC zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Procedura ta ma zastosowanie do NSC wywodzących się z H9. Inne linie komórkowe będą wymagały optymalizacji gęstości komórek.
- Policz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i dostosuj za pomocą pożywki NSC, aby uzyskać stężenie 7 x 106 komórek na ml.
- Zassać media z każdej studzienki chipa. Unikaj zasysania multimediów z głównych kanałów.
- Odpipetuj 5 μl roztworu komórkowego do prawego górnego dołka, a następnie 5 μl do prawego dolnego dołka (łącznie 70 000 komórek). Upewnij się, że komórki są pipetowane w kierunku głównych otworów kanału. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy komórki dostały się do kanału. Odczekaj 5 minut, aż komórki przylgną do dolnej części chipa.
nuta: Do załadowania ogniw można użyć jednej lub obu komór.
- Odpipetować ~150 μl pożywki NSC do prawego górnego dołka, a następnie 150 μl do prawego dolnego dołka. Powtórz po lewej stronie. Inkubować w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C w odpowiednim nawilżonym pojemniku.
- Po 48 godzinach odessać pożywkę NSC ze studzienek i zastąpić ją pożywką różnicującą neurony, dodając 150 μl do każdej studzienki górnej i każdej studzienki dolnej.
- Hodowla neuronów w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C w odpowiednim nawilżonym pojemniku.
