$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotować roztwór dysocjacji tkanek wykonany ze sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) zawierającego czerwień fenolową z papainą (100 j./ml), cysteiną (0,2 mg/ml) i dezoksyrybonukleazą (DNaza, 250 j./ml).
- Aby przygotować roztwór DNazy, rozcieńczyć 100 mg liofilizowanego proszku DNazy I (jedna butelka) w 50 mlH2O. Dobrze wymieszać i przefiltrować roztwór podstawowy. Przygotować 10 ml porcji podstawowych. Podzielić jedną probówkę podstawową na jednorazowe porcje o pojemności 0,5 ml. Porcje jednorazowego użytku należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przygotować odczynniki do separacji magnetycznej, przygotowując bufor kolumny magnetycznej X: 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
- Aby przygotować pożywkę neurosferyczną, należy użyć pożywki neurobazalnej zawierającej penicylinę/streptomycynę z L-glutaminą i uzupełnić 2% witaminy B27, 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20 ng/ml ludzkiego rekombinowanego podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
- Do przygotowania pożywki różnicującej należy użyć pożywki neuropodstawowej i uzupełnić ją 10 ng/ml płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF-AA) lub czynnika hamującego białaczkę 10 ng/ml (LIF) i 2% B27.
- Użyj bardzo niskich płytek hodowlanych 12 dołków (3,5 cm2) i 6 dołków (9,6 cm2).
2. Rozwarstwienie móżdżku
- Znieczulenie szczeniąt myszy (P3-P7) izofluranem i odcięcie głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- Spryskaj oddzielone głowy szczeniąt 70% etanolem.
- Przenieś każdą głowę do pustego sterylnego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm. Oddziel skórę za pomocą nożyczek do mikrodysekcji, a następnie usuń czaszkę, przesuwając nożyczki strzałkowo wzdłuż linii środkowej.
- Za pomocą kleszczy #7 oderwij kości czaszki, zaczynając doogonowo od pnia mózgu. Ostrożnie podnieś mózg za pomocą szpatułki, utrzymując móżdżek w stanie nienaruszonym, i przenieś mózg do świeżego sterylnego naczynia o średnicy 10,0 cm zawierającego 15 ml lodowatego roztworu soli Hanksa (HBSS).
- Umieść naczynie zawierające mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą cienkich kleszczy #5 usuń opony mózgowe i duże naczynia krwionośne z móżdżku i oddziel móżdżek od pnia mózgu za pomocą szpatułki.
- Przenieś móżdżek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5,0 ml lodowatego roztworu HBSS. Umyj móżdżek przez płukanie i dekantację 3x za pomocą 5,0 ml HBSS.
nuta: Każdy móżdżek należy umieścić we własnej rurce w celu dalszej obróbki.
3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
- Umieść naczynie zawierające mózg pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą cienkich kleszczy #5 usuń opony mózgowe i duże naczynia krwionośne z móżdżku i oddziel móżdżek od pnia mózgu za pomocą szpatułki.
- Przenieś móżdżek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5,0 ml lodowatego roztworu HBSS. Umyj móżdżek przez płukanie i dekantację 3x za pomocą 5,0 ml HBSS.
nuta: Każdy móżdżek należy umieścić we własnej rurce w celu dalszej obróbki.
- Po ostatnim płukaniu dodać 5 ml roztworu do dysocjacji tkanek na bazie papainy, który został wstępnie podgrzany do temperatury 37 °C. Inkubować tkankę przez 15 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej. Powoli wymieszaj zawartość, odwracając rurkę w górę iw dół 3x–5x co 3 minuty za pomocą miksera nutującego lub ręcznie.
- Przygotuj pipetę Pasteura o dużej średnicy (zwykła szklana pipeta) i pipetę Pasteura o wąskiej średnicy (polerowaną ogniowo przez ogrzewanie nad palnikiem Bunsena), jak opisano wcześniej.
- Umyj chusteczkę 3x 5 ml roztworu HBSS, unikając utraty tkanki podczas ręcznego dekantowania.
- Usunąć ostatnie płukanie HBSS i dodać do tkanki 5 ml roztworu DPBS zawierającego 250 μl roztworu DNazy. Dysocjacja tkanki przez rozcieranie 10x–15x za pomocą pipety Pasteura o dużej średnicy. Wykonaj ten krok delikatnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
- Następnie inkubować gnojowicę przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, mieszając przez odwrócenie i wyprostowanie probówki.
- Użyj pipety Pasteura o zmniejszonej średnicy, aby jeszcze bardziej rozprowadzić zawiesinę tkankową 10x. Jeśli pozostaną duże kawałki tkanki, delikatnie dociśnij je do dna probówki końcówką pipety i kontynuuj pipetowanie, aż komórki osiągną drobną zawiesinę.
- Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 10 minut, powtarzając poprzednie etapy mieszania.
4. Znakowanie immunologiczne komórek macierzystych
- Umieść probówki wirówkowe na lodzie i użyj lodowatych roztworów do kolejnych kroków. Przecedzić zdysocjowane komórki przez sitko o pojemności 40 μm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Na filtrze zalej 10,0 ml roztworu HBSS, aby upewnić się, że komórki przechodzą przez siatkę w tym dodatkowym roztworze.
- Przefiltrowane komórki przenieść do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odessać i całkowicie odrzucić supernatant ostrożnie za pomocą aspiratora próżniowego.
- Zawiesić osad w 160 μl bufora kolumny magnetycznej. Aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową przed etykietowaniem magnetycznym, przepuść komórki przez nylonową siatkę o grubości 30 μm, aby usunąć grudki komórek, które w przeciwnym razie mogą zatkać kolumnę.
- Dodaj 40 μl mikrogranulek anty-promininy-1 do każdej probówki o pojemności 15 ml, wymieszaj i inkubuj w lodówce przez 15 minut, aby przeciwciało związało się z komórkami wykazującymi ekspresję promininy-1.
- Przemyć komórki, dodając 1,0–2,0 ml buforu kolumnowego X i odwirować przy 300 x g przez 10 minut. Całkowicie odessać supernatant.
- Zawiesić osad w 1,0 ml buforu kolumnowego X.
nuta: Jeśli po ponownym zawieszeniu osadu w 1,0 ml buforu kolumnowego X widoczne są małe grudki, należy je ostrożnie usunąć za pomocą końcówki pipety Pasteura, w przeciwnym razie grudki te mogą zablokować kolumnę magnetyczną podczas sortowania komórek.
5. Przygotowanie kolumny magnetycznej, sortowanie komórek i powlekanie
UWAGA: Magnetyczna separacja od różnych warunków genotypu (choroba vs. kontrola) musi być przeprowadzona w tym samym czasie, ponieważ każde opóźnienie może wpłynąć na morfologię neurosfery.
- Przygotuj kolumny magnetyczne, umieszczając je na stojaku magnetycznym wystawionym na działanie pola magnetycznego. Przepłukać kolumnę raz 500 μl buforu X, nakładając bufor, który kapie do probówki wirówkowej w celu wyrzucenia.
nuta: Przygotować świeży bufor kolumny magnetycznej X dla każdego eksperymentu; Jeśli nie, to wydajność komórek macierzystych będzie niska.
- Nałóż oznaczone zawieszenie komórki na kolumnę. Zbierz przepływ zawierający nieznakowane komórki, które składają się głównie z mieszanych komórek neuronalnych / glejowych móżdżku, do świeżych probówek o pojemności 15 ml (ryc. 1A).
- Przemyć kolumnę 3x 500 μl buforu X (każde płukanie trwa około 2–4 min).
nuta: Mieszana kultura neuronalno-glejowa móżdżku wzbogacona o ziarniste neurony móżdżku może służyć jako użyteczny produkt uboczny tego etapu oczyszczania.
- Usuń kolumnę z pola magnetycznego i umieść ją w probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 1,0 ml pożywki hodowlanej (pożywki neurosferycznej) do kolumny i wcisnąć tłok do kolumny, aby wypłukać komórki oznaczone kulkami promininy-1 do świeżej probówki sokoła o pojemności 1,5 ml.
- Aby zwiększyć czystość komórek znakowanych promininą-1, przełóż eluowane komórki przez drugą kolumnę, wykonując kroki 5.1–5.4.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru. Typowa wydajność to 10-7 komórek na móżdżek. Umieść komórki na płytkach o bardzo niskim stopniu mocowania (6 lub 12-dołkowych, w zależności od gęstości wymaganej do dalszych eksperymentów).
6. Pasażowanie neurosfer i różnicowanie
- Umieść komórki macierzyste znakowane promininą-1 na 12-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu w pożywce neurosferycznej (5,000 komórek / dołek).
- Po 7–10 dniach komórki dzielą się, tworząc unoszące się w powietrzu neurosfery w kształcie kuli (neurosfery pierwotne).
nuta: W tym eksperymencie generowane są wtórne neurosfery, które rozszerzają się liczebnie do dalszego wykorzystania. Pierwotne populacje neurosfer nie są wykorzystywane w tych eksperymentach, ponieważ mogą zawierać zanieczyszczające komórki, które nie mają właściwości komórek macierzystych i mogą zlepiać się ze sobą z neurosferami.
- W celu pasażowania przenieś pierwotne neurosfery wraz z pożywką hodowlaną za pomocą końcówek pipet o pojemności 1,0 ml do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Granulować neurosfery przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
- Zawiesić osad w 5 ml pożywki dysocjacyjnej tkanek, która zawiera papainę lub 0,05% roztwór trypsyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki neurosferycznej i mechanicznie zdysocjować komórki za pomocą plastikowej pipety Pasteura i powoli pipetować w górę iw dół 10 razy.
- Umieść komórki (ponownie) w pożywkach neurosfery, jak opisano wcześniej. Po 7–10 dniach w hodowli płytkę należy wzbogacić o neurosfery wtórne.
nuta: Kultury te mogą być pasażowane do 8 razy z dobrą wydajnością, po czym rozmiar neurosfery jest zwykle mniejszy i sugeruje spadek proliferacji.
- Policz komórki na hemocytometrze i nałóż optymalną liczbę do przyszłych eksperymentów na płytkach pokrytych poli-D-lizyną (6 lub 12 dołków).
- Aby zróżnicować komórki macierzyste, zbierz neurosfery od drugiego do ósmego pasażu przez wirowanie, jak opisano wcześniej, z wyjątkiem dodania pożywki różnicującej do osadu.
nuta: Po 7 dniach in vitro komórki macierzyste różnicują się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty, co wykazano przez barwienie markerem neuronalnym tubuliną β-III, markerem astrocytarnym kwaśnym białkiem fibrylarnym gleju (GFAP) i markerem oligodendrocytów O4.
