Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Plamy żelowe macierzy zewnątrzkomórkowej
- Na dzień przed izolacją wykonaj następujące czynności:
- Rozmrozić podwielokrotność żelu macierzy zewnątrzkomórkowej (100 μl) w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1,5 godziny. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w zmodyfikowanym podłożu Eagle's firmy Dulbecco; z 4 500 mg/l glukozy, 4 mM L-glutaminą i 110 mg/ml pirogronianu sodu (DMEM). Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej należy utrzymywać przez cały czas w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Nagłe zmiany temperatury spowodują nierównomierną powłokę i tworzenie się kryształów.
- Rozcieńczony roztwór żelu macierzy zewnątrzkomórkowej należy przechowywać na lodzie przez 15 minut.
- Schładzaj mikropipetę o pojemności 20 μl przez 10 minut.
- Umieścić szkiełka z 8-dołkową komorą w szalce Petriego o średnicy 100 mm i przenieść naczynie na zimną powierzchnię (np. opakowanie do zamrażania) na 10 minut.
- Użyj wstępnie schłodzonej mikropipety, aby umieścić kroplę 10 μl żelu macierzy zewnątrzkomórkowej w każdym dołku. Trzymaj szalkę Petriego na zimnej powierzchni przez co najmniej kolejne 7 minut (Rysunek 1A).
- Całkowicie usunąć pozostały żel macierzy zewnątrzkomórkowej (ryc. 1B) i wysuszyć studzienki w temperaturze 37 °C przez noc.
2. Rozwarstwienie mięśni głowy (żwacz, dwubrzuś i dźwigacz veli palatini)
- Przed rosekcją należy przygotować 50 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionej 2% penicyliną-streptomycyną (P/S). Trzymaj na lodzie.
- Po eutanazji jednego młodego dorosłego szczura (9 tygodni) z CO2/O2 należy odciąć głowę i zdjąć skórę z głowy. Przenieś głowę do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 50 ml.
- Mięsień żwacz (wywodzący się z 1. łuku skrzelowego)
- Umieść głowę jedną stroną do góry na silikonowej podkładce i przymocuj ją igłami podskórnymi (Rysunek 2A).
- Zidentyfikuj śliniankę przyuszną i nerw twarzowy (ryc. 2A). Odsłoń głęboką powięź pokrywającą gruczoł. Przetnij powięź i usuń gruczoł za pomocą nożyczek preparacyjnych. Zidentyfikuj zewnętrzny przewód słuchowy. Prześledź nerw twarzowy z otworu rylcowo-sutkowego i ostrożnie usuń gałęzie skroniowe, jarzmowe i policzkowe za pomocą ostrza skalpela nr 15.
- Uwolnij powierzchowną głowę mięśnia żwacza, usuwając powięź. Zidentyfikuj zarówno powierzchowne, jak i głębokie głowy mięśnia żwacza. Śledź powierzchowną głowę, aż jej grube rozcięgno ścięgniste zostanie wstawione do wyrostka jarzmowego szczęki.
- Oddziel ścięgno od jego początku w wyrostku jarzmowym za pomocą prostych kleszczy. Przetnij go ostrzem skalpela nr 15 lub nożyczkami do preparowania i ostrożnie podnieś (Rysunek 2B).
- Wyciąć powierzchowną głowę żwacza do momentu jej włożenia pod kątem i dolną połową bocznej powierzchni ramienia żuchwy za pomocą ostrza skalpela nr 15 (ryc. 2C). Teraz całkowicie usuń mięsień.
- Tylny brzuch mięśnia dwubrzuścowego (wywodzący się z 2. łuku skrzelowego)
- Umieść głowę w pozycji leżącej na podkładce silikonowej i przymocuj ją igłami podskórnymi (ryc. 3A).
- Usuń podskórną tkankę tłuszczową pokrywającą gruczoły podjęzykowe i podżuchwowe. Następnie usuń powierzchowną powięź i gruczoły za pomocą nożyczek preparacyjnych. Odsłoń mięsień dwubrzuścowy (przedni i tylny brzuch).
- Przytrzymaj przednie ścięgno tylnego brzucha prostymi kleszczami, przetnij je i ostrożnie wypreparuj, aż znajdzie się w pęcherzu bębenkowym (ryc. 3B). Zrób to samo po stronie przeciwnej.
- Mięsień dźwigacza veli palatini (wywodzący się z 4. łuku skrzelowego)
- Po rozwarstwieniu tylnej części brzucha mięśnia dwubrzuścowego zlokalizuj mięsień rylcowaty, pociągnij go na bok i ostrożnie usuń (ryc. 4A).
- Zlokalizuj ścięgno dźwigacza veli palatini, które przyczepia się do pęcherza bębenkowego (ryc. 4A). Dokładnie go rozetnij i pokrój po obu stronach.
- Poszukaj tchawicy i przełyku, który biegnie za nią. Podnieś przełyk i odsłoń gardło i krtań.
- Zlokalizuj i wypreparuj obszar górnego mięśnia zwężającego gardło. Zidentyfikuj dźwigacz veli palatini i odetnij go po obu stronach (ryc. 4B).
nuta: Bezpośrednio po rozbiorze należy ostrożnie usunąć ścięgno i tkankę łączną z każdego mięśnia pod mikroskopem stereoskopowym. Szybko zanurz wszystkie próbki w 70% etanolu i przenieś je do lodowatego PBS uzupełnionego 2% P/S w probówce o pojemności 15 ml.
3. Izolacja komórek satelitarnych (SC)
- Wykonaj następujące kroki przygotowawcze do izolacji SC od trzech grup mięśni:
- Przygotować 7,5 ml 0,1% pronazy w DMEM. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm. Wstępnie ogrzać roztwór w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed izolacją.
- Przygotuj 35 ml DMEM uzupełnionego 10% surowicą końską (HS) i 1% P/S. Również wstępnie podgrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
- Przygotować 15 ml pożywki hodowlanej, która składa się z DMEM uzupełnionego 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 10% HS, 1% P/S i 1% ekstraktem z zarodków kurczaka (CEE). Wstępnie ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
- Sześć plastikowych pipet (10 ml) pokryć HS i wysuszyć przez co najmniej 10 minut przed użyciem.
- W kapturze hodowlanym przenieś każdy mięsień do dołka na płytce 6-dołkowej. Za pomocą nożyczek preparacyjnych przetnij mięsień na małe kawałki o wielkości około 2 mm. Uważaj, aby nie rozdrabniać tkanki zbyt mocno.
- Ostrożnie dodać 2,5 ml 0,1% roztworu pronazy do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Delikatnie wstrząsnąć płytką po 20, 40 i 60 minutach
nuta: Dokładny czas trwania inkubacji zależy od takich czynników, jak wiek i szczep zwierząt.
- Monitoruj pod mikroskopem. Sprawdź fragmenty mięśni i zatrzymaj trawienie enzymatyczne, gdy wiązki włókien wydają się rozluźnione (ryc. 5).
- Dodać 2,5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówki przy 400 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant przez dekantację.
- Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Odpipetować roztwór w górę i w dół za pomocą 10 ml plastikowej pipety (rozcieranie) co najmniej 20 razy w celu homogenizacji tkanki.
- Odwirować probówki o masie 200 x g przez 4 minuty. Zebrać supernatant i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml.
- Dodać 5 ml DMEM uzupełnionego 10% HS i 1% P/S. Ponownie odpipetować plastikową pipetą o pojemności 10 ml, aż fragmenty tkanki łatwo przejdą.
- Odwirować probówki o sile 200 x g przez 4 minuty i zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml.
- Umieścić sitko (40 μm) na probówce o pojemności 50 ml i przenieść supernatant zawierający zdysocjowane komórki na filtr. Przemyć 1 ml DMEM w celu maksymalnego odzyskania komórek.
- Odwirować probówki o masie 1 000 x g przez 10 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
- Zawiesić osad w pożywce hodowlanej o objętości 300 μl i policzyć komórki w hemocytometrze.
4. Różnicowanie komórek satelitarnych na plamkach żelowych macierzy zewnątrzkomórkowej
- Rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby uzyskać 1,5 x 103 komórki w 10 μl pożywki hodowlanej.
- Zabezpiecz pokrywy szkiełek komory taśmą i zaznacz miejsca czarnym markerem na spodniej stronie szkła obiektu.
- Za pomocą mikropipety nanieś kroplę 10 μl zawiesiny komórek na miejsce żelu macierzy zewnątrzkomórkowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropla zawiesiny komórek została prawidłowo umieszczona na miejscu. Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 °C.
- Ostrożnie dodać 400 μl pożywki hodowlanej (DMEM uzupełniony 20% FBS, 10% HS, 1% P/S i 1% CEE) i inkubować przez trzy dni w temperaturze 37 °C.
nuta: W tym momencie świeżo odizolowane SC są poddawane masywnemu urazowi (trawienie enzymatyczne i ostre roztarcie) i muszą dojść do siebie. Nie należy zakłócać pracy komórek przez pierwsze trzy dni. Następnie pożywkę hodowlaną można zmienić w zależności od rodzaju eksperymentu.
Plamki żelu macierzy zewnątrzkomórkowej można wysiewać z dużą gęstością komórek (1,5-2,5 x 103/20 μl) w celu przeprowadzenia testu różnicowania. Pożywkę hodowlaną (DMEM uzupełnioną 20% FBS, 10% HS, 1% P / S i 1% ekstraktu z zarodków kurczaka) można wymieniać co trzeci dzień.
