Neurogeneza indukowana kwasem retinowym przy użyciu mysich komórek raka embrionalnego

Streszczenie

Źródło: Leszczyński, P., et al., Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje prostą technikę neurogenezy wywołanej kwasem retinowym w komórkach raka embrionalnego myszy P19. Kwas retinowy aktywuje czynniki transkrypcyjne i wyzwala ekspresję genów w celu różnicowania neuronów.

Protokół

1. Generowanie agregatów

1. Dodać 5 μl RA (kwas retinowy) (1 mM bulionu rozpuszczonego w 99,8% etanolu, przechowywanego w temperaturze -20 °C) do 10 ml pożywki różnicującej i dobrze wymieszać (końcowe stężenie 0,5 μM RA).
   nuta: RZS jest wrażliwy na światło. Niskie stężenie etanolu nie wpływa na różnicowanie komórek.
2. Dodać 10 ml pożywki różnicującej (z RA) do niepoddanego działaniu substancji naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm (przeznaczonej do hodowli zawiesinowych).
3. Wysiewaj 1 x 10⁶ komórek w naczyniu o średnicy 100 mm (powierzchnia naczynia 56,5 cm2).
4. Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 2 dni w celu pobudzenia tworzenia agregatu.
5. Po 2 dniach wymień podłoże różnicujące. Odessać pożywkę zawierającą agregaty za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do probówki o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
6. Pozwól kruszywu osiadać grawitacyjnie przez 1,5 minuty przy suchej temperaturze względnej.
7. Odrzucić supernatant.
8. Dodać świeże 10 ml pożywki różnicującej z 0,5 μM RZS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
   ostrożność: Nie należy pipetować agregatów komórek w górę iw dół.
9. Wysiewaj kruszywa do nowego naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm bez obróbki (przeznaczonego do hodowli zawiesinowych).
10. Umieścić płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 )} na 2 dni.

2. Dysocjacja agregatów

1. Odessać agregaty komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
2. Przenieść kruszywa do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól agregatom komórek osiąść grawitacyjnie przez 1,5 minuty.
3. Usunąć supernatant.
4. Umyj agregaty samym DMEM (bez surowicy i antybiotyków).
5. Pozwól, aby agregaty komórek osiadły przez sedymentację grawitacyjną przez 1,5 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Odessać supernatant i dodać 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%).
7. Umieść agregaty komórkowe w łaźni wodnej (37 °C) na 10 minut. Delikatnie mieszaj agregaty co 2 minuty, stukając ręką.
8. Zatrzymaj proces trypsynizacji, dodając 4 ml pożywki konserwacyjnej.
9. Odpipetować agregaty w górę i w dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
10. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 200 x g i RT.
11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki konserwacyjnej.
12. Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.

3. Komórki poszycia

1. Dodać 3 ml pożywki konserwacyjnej na dołek do płytki 6-dołkowej.
2. Komórki nasienne w 6-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 0,5 x 10⁶/dołek.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przy stężeniu 5% CO_{2 .}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM wysoka glukoza (4,5 g/L) z L-glutaminą	Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Kwoty w europieniach	E5050-03
Penicylina/Streptomycyna 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x zatężona bez jonów wapnia i magnezu	Lonza	BE17-517Q
Kwas retinowy	Sigma- Aldrich	Czynnik chłodniczy R2625-50MG	Rozpuszczony w 99,8% etanolu; przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy
Trypsyna 0,25% - EDTA w HBSS, bez jonów wapnia i magnezu, z czerwienią fenolową	Surowice biologiczne	LM-T1720/500
1 ml pipet serologicznych	Profilab	515.01
Pipety serologiczne 10 ml	Profilab	515,1
Czasza 100 mm dedykowana do hodowli zawiesiny	Corning	C351029
Probówki wirówkowe 15 ml	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipety serologiczne 5 ml	Profilab	515.05
Płytka 6-dołkowa	Corning	CLS3516
Kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm kwadratowych	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA

powiedział: powiedział: szt. powiedział: KM powiedział: TGL