$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hodowla mysich fibroblastów embrionalnych (MEF)
- Przygotuj pożywkę MEF, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (DMEM, o wysokiej zawartości glukozy), uzupełnioną 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
- Pokryj 100 mm szalki do hodowli komórkowych 0,5% roztworem żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Policz MEF za pomocą cytometru. Usunąć roztwór żelatyny i natychmiast wlać pożywkę MEF podgrzaną do temperatury 37 °C. Szybko rozmrozić fiolki z MEF nasączone mitomycyną C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie wysiać 2,8 x 106 MEF na 100 mm naczynie pokryte żelatyną. Dostosuj odpowiednio numer komórki, jeśli używasz naczyń o innych rozmiarach. Inkubować MEF przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Zmień podłoże następnego dnia. Hodowla przez 2-3 dni, aż warstwa MEF się zlewa.
2. Embrionalna komórka macierzysta myszy lub hodowla ESC
- Przygotuj pożywkę ESC, zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) uzupełnioną 15% FBS i 103 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 0,1 mM aminokwasów endogennych, 55 mM 2-merkaptoetanolu, penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), gentamycyny (200 μg/ml) i 0,2% antybiotyku mykoplazmowego.
- Usuń podłoże MEF z naczynia przygotowanego w kroku 1 i zastąp je wstępnie podgrzanym podłożem ESC o temperaturze 37 °C.
- Rozmrozić fiolkę z ESC i komórki nasienne na wierzchu warstwy MEF. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż ESC osiągną konfluencję.
- Przygotuj nowe naczynia do hodowli komórkowych zawierające zlewającą się monowarstwę MEF. Aby przejść przez ESC, przemyj raz PBS i odłącz 0,25% trypsyny/EDTA na 2-5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zatrzymaj trypsynizację, dodając świeży IMDM z 15% FBS do oddzielających się komórek, przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć supernatant, ponownie zawiesić ESC z nowym IMDM i przejść jedną piątą komórek do każdego nowego naczynia pokrytego MEF; inkubować, aż komórki osiągną zbieżność (zwykle 4-5 dni).
3. Wycofaj MEFy i ESC do hodowli na płytkach pokrytych żelatyną
- Gdy ECS osiągną zbieg, odłącz je i MEF z 0,25% trypsyny/EDTA, jak w kroku 2.4, ponownie zawieś komórki w świeżym IMDM, przenieś na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego i inkubuj przez 40 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Ostrożnie przenieść ESC i pożywkę zawierającą MEF na nową płytkę pokrytą żelatyną za pomocą pipety o pojemności 5 ml, unikając wielokrotnego pipetowania. Komórki pozostające na szalkach Petriego są MEF-ami, ponieważ ESC nie przylegają.
- Przechodź przez ESC co 3-4 dni. Rzadsze pasażowanie może zmniejszyć pluripotencję ESC. Nie przekraczaj 60% zbiegu, ponieważ może to sprzyjać różnicowaniu.
- Powtórz kroki 3.2-3.3 trzy lub więcej razy, w zależności od potrzeb, aż MEF-y nie będą już wykrywalne przez mikroskop hodowli komórkowych, przy użyciu obiektywu 20X, aby upewnić się, że MEF-y nie są obecne.
- Sprawdź pluripotencję ESC, sprawdzając hodowlę ESC, aby sprawdzić, czy komórki tworzą gęste kolonie o typowej morfologii wielokątnej ESC (Figura 1A). Przetestuj macierzystość komórki za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR), immunoblottingu lub immunofluorescencji podstawowych czynników transkrypcyjnych pluripotencji (ryc. 2).
4. Formacja EB
- Przygotować roztwór podstawowy all-trans-RA o stężeniu 10 mM w DMSO i podzielić go na 1,5 ml chronionych przed światłem probówek do mikrodymowania. Roztwór jest stabilny w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch tygodni. Chroń go przed światłem.
- Trypsynizować ESC jak w kroku 2.4; ponownie platerować w świeżym IMDM bez LIF jako zawiesinę jednokomórkową.
- Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę 5 x 105 komórek/ml w IMDM z 0,5 μM RA.
- Umieść 100 kropli 20 μl na 100-milimetrową szalkę Petriego za pomocą 8-kanałowej pipety i końcówek o pojemności 200 μl, odwróć szalki i napełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli. Chronić pożywki hodowlane zawierające RZS przed światłem.
- Kultura EB w wiszących kroplach w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 dni.
