1. Klonowanie 2K7 Lentivector
- Przed sklonowaniem interesującego genu do wektora lentiwirusowego 2K7, należy sklonować gen do wektora pENTR (3637 pz, oporny na kanamycynę) przy użyciu standardowych technik molekularnych. Do podklonowania należy użyć witryn ograniczeń EcoRI i SacII.
- Wzmocnienie wektora lentiwektorowego 2K7
- Przekształć DNA lentiwektora 2K7, delikatnie mieszając 100 ng plazmidowego DNA z kompetentnymi komórkami i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
- Szok termiczny DNA / kompetentne komórki mieszają się w temperaturze 42 °C przez 90 sekund i umieszczają je na płytkach LB-Agar zawierających zarówno ampicylinę (100 μg / ml), jak i chloramfenikol (15 μg / ml) w temperaturze 37 °C przez 16-18 godz.
UWAGA: Chloramfenikol stosuje się w celu zapobieżenia rekombinacji między długimi powtórzeniami końcowymi.
- Następnego dnia hoduj wybrane klony bakteryjne w pożywce Luria-Bertani (LB) zawierającej zarówno ampicylinę (100 μg/ml), jak i chloramfenikol (15 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin. Wyodrębnij DNA za pomocą komercyjnego zestawu plazmidowego DNA Maxiprep zgodnie z instrukcjami producenta.
- Podklonowanie z wektora pENTR do wektora 2K7 (rysunek 1).
- Do probówki o pojemności 1,5 ml dodać i delikatnie wymieszać: L4-R1 pENTR-pDNOR-CMV (promotor) (60 bng)1-2,5 μl L1-L2 pENTR4IRES2GFP (z interesującym genem) (80 bng)1-2,5 μl K7 lentivector (80 ng/μl)1 μl TE-buffer, pH 82-5 μl.Razem 8 μl.
- Usunąć mieszaninę enzymów klonazy z temperatury -80 °C i rozmrażać na lodzie przez 2 minuty. Upewnij się, że enzym ten jest świeżą porcją o temperaturze od -80 °C, ponieważ enzym ten znacznie zmniejszył wydajność klonowania przy powtarzających się cyklach zamrażania i rozmrażania
- Dodać 2 μl enzymu na reakcję i dobrze wymieszać przez wir, a następnie inkubować mieszaninę reakcji klonazy w temperaturze 23-25 °C przez 6-24 godziny.
- Dodać 1 μl roztworu proteinazy K (dostarczonego z zestawem enzymów) do mieszaniny reakcji klonazy i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Przekształć mieszaninę reakcyjną klonazy w kompetentne komórki i hodować wybrane kolonie w pożywce LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
- Wyodrębnij i oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu Miniprep plazmidowego DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
- Potwierdź DNA poprzez trawienie przy użyciu enzymów restrykcyjnych Spe I i Sac II oraz odpowiedniego buforu zgodnie z instrukcją producenta, aby usunąć fragment zawierający promotor i gen będący przedmiotem zainteresowania.
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla sprawdzenia, czy subklonowane DNA ma prawidłowy gen insercyjny, który jest przedmiotem zainteresowania, z odpowiednim szkieletem wektora. Rozmiar samego wektora bez wstawionego fragmentu wynosi 6,7 kb. Wielkość uwolnionego wstawionego fragmentu obejmuje zarówno promotor, jak i gen insercyjny będący przedmiotem zainteresowania. Oblicz oczekiwane rozmiary fragmentów na podstawie wytrawienia dla określonego genu za pomocą programu do edycji sekwencji DNA, np. APE-A Plasmid Editor.
- Sprawdź rozmiary zarówno szkieletu wektora DNA, jak i uwolnionego fragmentu, uruchamiając 1% żel agarozowy w 1x buforze TAE (patrz Tabela 1) pod napięciem 100 V.
- Amplifikować potwierdzone DNA poprzez hodowlę bakterii w 500 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
- Wyodrębnij i oczyść DNA za pomocą komercyjnego zestawu plazmidowego DNA Maxiprep zgodnie z instrukcjami producenta.
nuta: Maxiprep zazwyczaj generuje wystarczającą ilość DNA potrzebną do produkcji wirusa.
- Powtórz kroki 1.3.9-1.3.10 w celu amplifikacji następujących DNA dla preparatów lentiwirusowych: Wektor otoczki (PMD2. G, 6.1 kb), wektor pakietu (pBR8.91, 12.5 kb) i pusty wektor lentiwirusowy jako kontrola (GFP-CMV-2K7, 8.7 kb).
2. Produkcja wirusa 2K7
UWAGA: Dzień 1:
- W dniu transfekcji umieścić 32 miliony limfocytów T HEK293 w kolbie T175 zawierającej 25 ml pożywki z 293 limfocytów T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) (patrz Tabela 1). Alternatywnie, płytko 16 milionów komórek na dzień przed transfekcją, jeśli czas jest napięty w dniu transfekcji.
nuta: Transfekcja może być równie skuteczna poprzez posiew komórek w dniu transfekcji lub przed tym dniem. Korzystając z jednej z dwóch alternatyw, krytycznym punktem jest upewnienie się, że komórki są przyklejone do powierzchni szalki hodowlanej przed transfekcją.
nuta: Dzień 2:
- Transfekcja
- Przed transfekcją rozcieńczyć DNA do 1 μg/μl w buforze kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (TE) zawierającym 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA pH 8 w wodzie dejonizowanej.
- W probówce o pojemności 50 ml przygotować mieszankę wzorcową (Tabela 2) do transfekcji w kolbie T175. Dodać DNA do wstępnie podgrzanego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle Medium (DMEM) i dobrze wymieszać przez wir, a następnie dodać sterylną polietylenoiminę (PEI) (patrz Tabela 1, aby uniknąć przedwczesnego wytrącania się.
- Dobrze wymieszaj, odwracając probówkę 3-4x i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
- Wykonaj pełną wymianę nośnika na HEK293T komórkach. Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z komórek i karmić wstępnie podgrzaną pożywką do hodowli komórkowych HEK293T (25 ml na kolbę T175).
- Dodawać mieszaninę transfekcji (mieszaninę DNA/PEI) kroplami do komórek jednowarstwowych. Poruszać delikatnie, aby dobrze wymieszać i inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2, przez noc.
UWAGA: Dzień 3:
- Aby upewnić się, że transfekcja się powiedzie, sprawdź ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) 24 godziny po transfekcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
nuta: Ponad 50% komórek wykazujących ekspresję GFP zazwyczaj wskazuje na dobrą transfekcję.
nuta: Dzień 4:
- Po 48 godzinach od transfekcji zebrać supernatant wirusa i zastąpić go świeżą pożywką HEK293 T (25 ml na kolbę T175).
- Odwirować supernatant wirusa przy 1,140 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórkowych z supernatantu. Przenieść oczyszczony supernatant do probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Dzień 5:
- Po 72 godzinach od transfekcji zebrać drugą partię supernatantu wirusa. Powtórzyć krok 2.3.1 i połączyć oczyszczone supernatanty po 48 i 72 godzinach.
- W celu zagęszczenia wirusa należy odwirować supernatant wirusa o stężeniu 170 000 x g przez 90 minut w temperaturze 4 °C za pomocą probówek ultrawirówek o pojemności 30 ml.
- Odrzucić sklarowany osad i powtarzać krok 2.6 aż do momentu, gdy cały oczyszczony sklarowany supernatant zostanie odwirowany, pozostawiając (niewidoczną) osadkę wirusa i wytrącony PEI w podstawie probówki.
- W celu ponownego zawieszenia wirusa należy dodać 500 μl pożywki SATO (patrz Tabela 1) do probówek ultrawirówek. Wiruj przez 30 sekund i zeskrob podstawę probówki końcówką pipety, aby mechanicznie poluzować wirusa. Powtórz ten krok 6 razy, aby stracić osad wirusa.
- Umieścić zawieszonego wirusa w probówkach do mikrowirówek i bardzo krótko odwirować, aby usunąć nierozpuszczalny PEI. Przefiltruj supernatant przez filtr 0,45 μm, aby usunąć białka.
- Podwielokrotność wirusa podzielić na 20 μl, 50 μl i 100 μl podwielokrotności i przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Transdukcja OPC
- Hodowla pierwotnych OPC w pożywce SATO (płytka 10 ml / 10 cm) z rzęskowym czynnikiem neurotroficznym (CNTF, 10 ng / ml), płytkowym czynnikiem wzrostu (PDGF, 10 ng / ml), neurotrofiną 3 (NT3, 1 ng / ml) i forskoliną (4,2 μg / ml) w temperaturze 37 °C, 8% CO2 przez 24 godziny po rozwarstwieniu.
- Całkowicie odessać pożywkę hodowlaną OPC i nakarmić komórki świeżo przygotowanym podłożem SATO (10 ml) z czynnikami wzrostu (patrz powyżej w kroku 3.1).
- Dodać wirusa do OPC do optymalnego stężenia, hodować OPC przez kolejne 48 godzin.
4. Siew OPC dla kokultur mielinizacyjnych (Rysunek 2)
- Aby usunąć OPC z powierzchni, najpierw dwukrotnie przepłucz płytki OPC 8 ml zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS), a następnie inkubuj komórki z 5 ml ciepłej 0,05% trypsyny-EDTA rozcieńczonej w stosunku 1:10 z EBSS w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
- Zneutralizować trypsynę za pomocą 30% FBS w EBSS (5 ml) i usunąć komórki z płytki za pomocą pipetowania. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 180 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
- Odessać sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SATO, a następnie rozpocząć liczenie komórek.
- Przed siewem OPC należy całkowicie odessać pożywkę z płytki hodowlanej DRG. Delikatnie rozmieść 200 000 OPC kroplami na neurony DRG, jak opisano wcześniej.
nuta: Całkowita objętość wysiewu OPC musi być mniejsza niż 200 μl na szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm.
- Pozostawić komórki do osadzenia się bez przesuwania płytki na 10 minut w kapturze do hodowli tkankowych, a następnie delikatnie uzupełnić 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki SATO na dołek.
- Ponownie pokryć pozostałe siostrzane OPC pożywką SATO z czynnikami wzrostu (patrz krok 6.1). Użyj tych siostrzanych OPC, aby zweryfikować ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania.
- Po 24 godzinach zastąp pożywkę SATO pożywką kohodowlaną (2 ml/basenie) zawierającą pożywkę SATO (brak czynników) i neurobazalną (v/v) z 1% B2Utrzymuj kokultury przez 14 dni ze zmianą pożywki co 2-3 dni.
- Oceń kokultury pod kątem ekspresji białka mieliny za pomocą analizy western blot i zwizualizuj tworzenie mielinowych segmentów aksonalnych przez podwójne barwienie immunologiczne przeciwciałami przeciwko podstawowym markerom białkowym mieliny i markerom neuronalnym.
