$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Ręczne sortowanie fluorescencyjnie znakowanych neuronów myszy
- Pociągnij szklane mikrokapilary (patrz tabela materiałów) do średnicy wyjściowej 10–15 μm za pomocą ściągacza kapilarnego z następującymi ustawieniami: ciepło: 508, pociągnięcie: ślepe, vel: puste, czas: puste.
- Podłącz elastyczną rurkę silikonową o długości 120–150 cm (średnica wewnętrzna ~0,8 mm) do membranowego filtra strzykawkowego z polifluorku winylidenu (PVDF) o średnicy 0,2 μm i dwukierunkowego zaworu rurkowego za pomocą odpowiednich łączników do rurek.
- Przygotować 500 ml schłodzonego (4 °C) sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF, Tabela 1) i natlenić przez bulgotanie 5% tlenu o stężeniu dwutlenku węgla przez kamień napowietrzający przez 15 minut lub do momentu, gdy roztwór całkowicie się klaruje.
- Przygotuj 100 ml ACSF z koktajlem blokerów aktywności w zlewce o pojemności 150 ml (Tabela 1).
- Przygotować 100 ml ACSF z 1 mg/ml proteazy IV frakcji Streptococcus w zlewce o pojemności 150 ml (Tabela 1).
- Przygotować 100 ml ACSF z 1% roztworem płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w zlewce o pojemności 150 ml i natlenić 5% dwutlenkiem węgla przez kamień napowietrzający.
- Wypreparuj mózg myszy poddanej eutanazji, otwierając czaszkę małymi nożyczkami i wydobywając świeży mózg za pomocą cienkich kleszczy bez uszkadzania kory mózgowej.
nuta: Myszy dowolnej odmiany, wieku i płci mogą być używane zgodnie z potrzebami. Nie zamrażaj mózgu ani nie wykonuj ręcznego sortowania na myszach, którym wstrzyknięto wirusy lub inne niebezpieczne/zakaźne czynniki.
- Utrzymuj mózg w schłodzonym i natlenionym ACSF, pozostawiając kamień napowietrzający przyczepiony do 5% dwutlenku węgla, który równoważy tlen przez cały czas trwania sekcji.
- Umieść mózg na uchwycie wibratomicznym i wytnij odcinki czołowe lub strzałkowe o grubości 300 μm. Zbierz tyle sekcji, ile potrzeba, aby uzyskać co najmniej ~10–50 oznaczonych komórek do kilkuset komórek. Połóż plastry na uchwycie na plastry z bawełnianą siatką, umieszczonym w zlewce, tak aby były skąpane w natlenionym ACSF.
- Przenieś świeże plastry do zlewki zawierającej ACSF z blokerami aktywności i blokuj przez 15–20 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj bulgotanie tlenu za pomocą kamienia napowietrzającego.
- Przenieś plastry do zlewki zawierającej ACSF z roztworem proteazy, aby przeprowadzić łagodne trawienie w temperaturze pokojowej: 20–30 minut dla zwierząt P4-14 lub do 45–60 minut dla zwierząt P28-56. Kontynuuj bulgoczący tlen.
- Wypłukać ACSF proteazą, przenosząc plastry z powrotem do zlewki zawierającej ACSF z roztworem blokerów aktywności przez 5–10 minut w temperaturze pokojowej. Kontynuuj bulgoczący tlen.
- Przenieść poszczególne sekcje na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą ACSF z 1% FBS w temperaturze pokojowej. Pod fluorescencyjnym zakresem preparacji mikrodyparuj obszary i warstwy zainteresowania mające co najmniej 10-50 komórek (do kilkuset). Wykonaj mikrodysekcję za pomocą cienkich kleszczy lub przymocowując igły iniekcyjne o wadze 22–28 G do drewnianych uchwytów (szaszłyków).
- Za pomocą pipety Pasteura przenieś wycięte kawałki do probówki o pojemności 2 ml zawierającej ~0,8 ml 1% FBS w roztworze ACSF.
- Rozwarstwioną tkankę należy rozwarstwić w probówce do mikrofugi w temperaturze pokojowej. Wykonaj trzy pipety Pasteura z długimi nóżkami o zmniejszających się średnicach wylotów, przetaczając je nad otwartym ogniem. Wykonaj ~10 pociągnięć każdą pipetą, zaczynając od największej, a kończąc na najmniejszej.
- Dozować zdysocjowane komórki na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą natleniony ACSF (w razie potrzeby szalkę Petriego można cienko pokryć 5 mm 1% agaru lub klarownego związku silikonowego w stosunku 1:10). Przechowywać w temperaturze pokojowej.
- Odczekaj ~5-7 minut, aż komórki stopniowo się uspokoją, a następnie obserwuj sygnał GFP/RFP pod mikroskopem preparacyjnym.
nuta: Pojedyncze komórki, szczątki i małe grudki będą widoczne w jasnym polu (BF).
- Pobieraj jednorazowo 10–15 komórek GFP/RFP za pomocą pipety kapilarnej (z kroku 1.1) przymocowanej do elastycznej silikonowej rurki (średnica wewnętrzna 0,4–0,8 mm) i dozuj komórki do 100-milimetrowej szalki Petriego zawierającej świeżo natleniony ACSF.
- Blokując koniec zaworu rurki językiem, umieść kapilar blisko interesującej się komórki. Po odciążeniu bloku należy wychwycić komórki za pomocą działania kapilarnego i szybko zablokować je ponownie, aby zapobiec przedostawaniu się nadmiaru płynu do pipety. Dozować komórki na 100-milimetrową szalkę Petriego ze świeżo natlenionym ACSF, delikatnie, obserwując końcówkę kapilary pod optyką fluorescencyjną mikroskopu preparacyjnego. Staraj się zebrać łącznie ~100–150 komórek.
- Powtórz krok 1.19 jeszcze raz lub dwa razy (w zależności od zanieczyszczeń) i przenieś w sumie ~50–75 komórek na nową szalkę Petriego o średnicy 100 mm, upewniając się, że zanieczyszczenia, takie jak zanieczyszczenia, są minimalne w optyce DIC (Different-field Differentance Contrast
).
Tabela 1: Lista rozwiązań i.
Rozdział
szt.
| bufor | przedmiot | koncentracja | Ilość (μL) |
| Bufor do pobierania próbek | Rekombinowany inhibitor rybonukleazy | | 55 |
| Rcc | Rozcieńczony 1:50K | Rozdział 110 |
| Woda wolna od nukleaz | | 605 |
| Porcjować 43,75 μl powyżej do 16 probówek (2 paski po 8; 200 μL probówek PCR); dodać następujące elementy na probówkę |
| Podkłady UMI (np. N10B1-N10B16) | 1 ng/μl | 6,25 μl/probówkę |
| Końcowa objętość w każdej probówce: 50 μL (każdą probówkę można podzielić na 25 μL i zamrozić w temperaturze -80 °C) |
| Rozwiązania: | przedmiot | koncentracja | kwota |
| CSF: do rozpuszczenia 5 l | Zawartość NaCl | 126 mM | 36,8 gr |
| Kcl | 3 mM | 1,15 gr |
| NaH2PO4 | 1,25 mM | 0,75 grama |
| NaHCO3 | 20 mM | 8,4 gr |
| Do 500 ml ACSF, bąbelkować tlen przez 10-15 minut, a następnie dodawać za każdym razem świeże: |
| D-glukoza | 20 mM | 1,8 gr |
| MgSO4 | 2 mM | 0,5 ml z 4 mln zapasów |
| CaCl2 | 2 mM | 0,5 ml z 4 mln zapasów |
| Utrzymuj ACSF natleniony przez cały czas. |
| Rozwiązania: | przedmiot | Koncentracja |
| Koktajl blokujący aktywność: zrób 100-krotny zapas |
| Do 100 ml ACSF dodać | | |
| APV (Wirus Piłki | 0,05 mM | |
| Sieć CNQX | 0,02 mM | |
| Mechanizm TTX | 0.0001 mM (0.1 μM) |
| Rozwiązania: | przedmiot | kwota | |
| Roztwór proteazy (100 ml) | Proteaza ze Streptomyces griseus | 100 mg tabletki powlekania | |
| Surowica bydlęca płodu: źródło handlowe, porcja w 500 μL do każdego użycia. |