1. Pobieranie i hodowla komórek linii OL (OL)
UWAGA: Te kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
- Następnego dnia po wstrząśnieniu przygotować pożywkę Bottensteina-Sato (BS) zgodnie z tabelą 1.
- Opłucz pokryte szalki Petriego 3 razy sterylną wodą destylowaną.
- Zebrać supernatant kolb zawierający głównie komórki linii OL, ale także niektóre komórki mikrogleju i umieścić go na niepowlekanych 100-milimetrowych szalkach Petriego.
nuta: Ten etap umożliwia usunięcie komórek mikrogleju poprzez szybkie przyleganie różnicowe do powierzchni naczynia.
- Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Napełnić każdą kolbę T150 25 ml ciepłej, świeżo przygotowanej pożywki hodowlanej i inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 do drugiego wstrząsu.
- Przenieść supernatant z płytek Petriego do nowych, niepowlekanych płytek Petriego o średnicy 100 mm, aby umożliwić przyleganie pozostałych komórek mikrogleju.
- Inkubować szalki Petriego przez 15 minut w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Usunąć supernatant, który zawiera nieprzylegające komórki linii OL i przenieść go do probówek o pojemności 50 ml (supernatant z 2 szalek Petriego na probówkę o pojemności 50 ml). Wyrzuć szalki Petriego pokryte mikroglejem.
- Odwirowywać supernatant przez 5 minut przy 423 x g. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml pożywki BS. Zbierz wszystkie granulki we wspólnej probówce o pojemności 50 ml i dostosuj objętość do 10 ml za pomocą pożywki BS.
- Określ gęstość komórek, zliczając komórki pod mikroskopem.
nuta: Należy uzyskać gęstość komórek między 3 x 105 komórek/ml i 5 x 105 komórek/ml.
- Dodać 20 ml BS, jeśli gęstość komórek jest większa lub równa 4 x 105 komórek/ml, aby uzyskać końcową objętość 30 ml, lub dodać tylko 10 ml BS, jeśli gęstość komórek jest mniejsza niż 4 x 105 komórek/ml, aby uzyskać końcową objętość 20 ml.
- Dwie lub trzy wstępnie pokryte 100 mm szalki Petriego należy umieścić na płytce 10 ml zawiesiny komórek. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Usuń zanieczyszczenia z szalek Petriego, odświeżając całe podłoże BS 2 godziny później.
nuta: Zbadaj kulturę pod mikroskopem przed i po oczyszczeniu, aby zweryfikować gęstość komórek i skuteczność usuwania zanieczyszczeń.
- Inkubować przez 2 dni w podłożu BS w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2,
nuta: Zbadaj kulturę pod mikroskopem. Zbieg powinien wynosić od 70% do 80%.
2. Produkcja OCM
UWAGA: Wykonaj te kroki w okapie z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
- Przygotować NB-B27low medium zgodnie z tabelą 2.
- Odnowić pożywkę hodowlaną za pomocą 10 ml ciepłej pożywki NB-B27low. Inkubować przez 2 dni w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 .
- Zbierz OCM, tj. supernatant zawierający czynniki wydzielane przez OL. Sterylizuj OCM za pomocą filtra 0,22 μm.
nuta: Przechowywać OCM w temperaturze 4 °C maksymalnie 2 miesiące.
Tabela 1: Przygotowanie nośników Bottenstein-Sato (BS).
| Bottenstein-Sato (BS) media | Końcowe stężenie |
| Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco Medium | |
| Penicylina-Streptomycyna | 100 j.m./ml |
| apo-Transferyna ludzka | 100 μg/ml |
| BSA (albumina surowicy bydlęcej) | 100 μg/ml |
| insulina | 5 μg/ml |
| PDGF (Biblioteka PDGF) | 10 ng/ml |
| progesteron | 62 ng/ml |
| Dichlorowodorek putrescyny | 16 μg/ml |
| Selenin sodu | 40 ng/ml |
| T3 (sól sodowa 3,3',5-trijodo-L-tyroniny) | 30 ng/ml |
| T4 (L-tyroksyna) | 40 ng/ml |
Tabela 2: Przygotowanie nośników NB-B27low i NB-B27.
| NB-B27 - niski poziom nośników | Końcowe stężenie |
| Neuropodstawowy | |
| Suplement witaminy B27 | 0,5 razy |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicylina-Streptomycyna | 100 j.m./ml |
| Nośniki NB-B27 | Końcowe stężenie |
| Neuropodstawowy | |
| Suplement witaminy B27 | 1x |
| L-glutamina | 0,5 mM |
| Penicylina-Streptomycyna | 100 j.m./ml |
