- Podzielona na przedziały hodowla zwojów korzenia grzbietowego szczura (DRG), oligodendrocytów (OPC) i hGC (ludzkich komórek glejaka)
1. Przygotowanie potraw z kulturami z podziałem na przedziały
UWAGA: Wykonaj następujące kroki na kilka dni przed planowanym zbiorem DRG.
- Złóż naczynia hodowlane z przegródkami.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy kolagenu do 500 μg/ml w sterylnym destylowanymH2O; dokładnie wymieszać.
- Za pomocą sterylnej pipety transferowej napełnij naczynie hodowlane o średnicy 35 mm 2 ml roztworu kolagenu; usuń roztwór, pozostawiając cienki film kolagenowy, i umieść go w następnym naczyniu o średnicy 35 mm. Powtórz ten proces, dodając w razie potrzeby więcej roztworu kolagenu, aż wszystkie naczynia zostaną pokryte.
- Gdy wszystkie płytki zostaną pokryte, umieść je w tacce hodowlanej o wymiarach 245 mm x 245 mm i połóż trzy gaziki o wymiarach 1 mm x 1 mm na środku tacy.
- Aby spolimeryzować kolagen, zwilż gaziki 1 ml stężonego wodorotlenku amonu i przykryj tacki na 15 minut.
- Zdejmij gaziki i pozostaw naczynia o średnicy 35 mm do wyschnięcia w okapie z przepływem laminarnym.
- Podczas suszenia naczyń załaduj cylinder aplikatora smaru strzykawkowego smarem o wysokiej próżni. Umieść komory z przedziałami w dużej butelce z płynem do ust wypełnionej wodą destylowaną. Sterylizuj zarówno przez autoklawowanie, jak i pozostaw do ostygnięcia.
- Spiłuj czubek igły 18-G, aby uzyskać końcówkę. Sterylizować w 70% etanolu. Przymocować igłę do strzykawki ze smarem.
- Wysterylizuj grabie do szpilek, mocząc je w 70% etanolu; pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w okapie z przepływem laminarnym.
- Zdejmij pokrywkę z suchego, pokrytego kolagenem naczynia o średnicy 35 mm. Trzymaj naczynie między kciukiem a palcem wskazującym. Drugą ręką przytrzymaj grabie do szpilek. Mocno dociśnij, aby stworzyć równomierne rysy o szerokości 200 μM na środku naczynia.
- Za pomocą pipety pastwiskowej umieść dwie krople Supplemented Neuronal Basal Medium w środku zadrapań.
- Powtarzaj kroki 1.1.10-1.1.11, aż wszystkie naczynia zostaną porysowane.
- Wysuszyć komory z przedziałami w okapie z przepływem laminarnym.
- Za pomocą sterylnych kleszczy hemostatycznych chwyć jedną komorę z przegrodą środkową. Odwróć kleszcze hemostatyczne tak, aby dno komory było skierowane do góry.
- Nałóż smar silikonowy na komorę z komorami, zaczynając od góry. Upewnij się, że smar jest starannie ułożony i zachodzi na siebie we wszystkich rogach.
- Zdejmij pokrywkę z naczynia o średnicy 35 mm. Odwróć naczynie i umieść rysy nad komorą. Delikatnie postukaj w spód płytki za pomocą kleszczy.
- Delikatnie odwróć płytkę za pomocą kleszczy hemostatycznych. Zwolnij kleszcze.
- Umieść kopiec smaru u podstawy środkowej komory. Napełnij każdą komorę uzupełnionym podłożem neuronalnym (NB) i sprawdź, czy nie ma wycieków. W razie potrzeby uszczelnij nieszczelności smarem silikonowym.
- Kontynuuj składanie wszystkich naczyń hodowlanych i przechowuj je przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO2 .
