Izolowanie fałdów nerwowych czaszki od zarodka kurcząt w celu hodowli komórek grzebienia nerwowego

Streszczenie

Źródło: Jacques-Fricke, B. T., et al. Przygotowanie i analiza morfologiczna kultur komórek grzebienia nerwowego piskląt. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film ilustruje technikę izolowania fałdów nerwowych czaszki od śródmózgowia zarodków piskląt. Przedstawiono szczegółowy proces rozwarstwiania fałdów nerwowych, ich rozmieszczenia i mocowania na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, a następnie obserwację migracji komórek grzebienia nerwowego z fałdów nerwowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

1. Przygotować roztwór Ringera, mieszając 123,3 mM NaCl, 1,53 mM CaCl₂, 4,96 mM KCl, 0,809 mM Na₂HPO₄ i 0,147 mM KH₂PO₄ (patrz tabela materiałów). Dostosuj pH do 7,4 i przefiltruj sterylizację do butelek o pojemności 100 ml. Przechowywać w czystym, suchym miejscu. Nie myj butelek mydłem (traktuj jako szkło do kultur tkankowych).
2. Przygotować 1 mg/ml roztworu podstawowego fibronektyny (FN) (patrz tabela materiałów) przez rozpuszczenie FN w sterylnym roztworze Ringera i przechowywać w 100 μl podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C (stabilnie przez co najmniej 4 lata).
3. Przygotuj kompletne pożywki hodowlane, uzupełniając pożywkę L15 0,8% L-glutaminą, 0,08% penicyliną/streptomycyną, 10% FBS i 10% ekstraktem z zarodków piskląt. Utworzyć 3 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
   nuta: Jeśli kultury są inkubowane w inkubatorze CO_{2 ,} zmodyfikowane podłoże Eagle Medium F12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) należy zastąpić L15, który jest buforowany dla powietrza.
4. Przygotuj ramki nośne z bibuły filtracyjnej (prostokąty papieru o wymiarach około 1 cm x 1,5 cm z dwoma lub trzema dziurkowanymi otworami zachodzącymi na siebie na długiej osi).
   1. Za pomocą standardowego dziurkacza z trzema otworami wybij otwory wzdłuż krawędzi dużego kawałka bibuły filtracyjnej, wytnij/przytnij wybitą krawędź w pasek, a następnie pokrój pasek między otworami na prostokąty o długości ~ 1,5 cm. Bibuły filtracyjne do autoklawu przed użyciem (opcjonalnie).
5. Zbierz narzędzia do preparowania, w tym cienkie kleszcze (#4), kleszcze, nożyczki do preparacji, nożyczki sprężynowe i zaostrzone igły wolframowe.

2. Przygotowanie potraw kulturowych

1. Wybierz szalki hodowlane fałdów nerwowych (patrz tabela materiałów) odpowiednie dla dalszego zastosowania.
   1. W przypadku kultur, które będą utrwalane i barwione, należy użyć szklanych szkiełek nakrywkowych umieszczonych w wielodołkowych szalkach do hodowli tkankowych.
      nuta: Szkiełka nakrywkowe, które pasują do wielkości studzienki, będą się mniej poruszać przy mieszaniu płynów, dzięki czemu eksplantaty będą mniej podatne na przesuwanie się i bardziej prawdopodobne jest, że przylgną do szkiełka nakrywkowego, a nie do dna naczynia.
   2. Wybierz naczynia jednokomorowe ze szklanym dnem lub dzielone (patrz tabela materiałów) do obrazowania na żywo za pomocą mikroskopu odwróconego.
   3. Do obrazowania na żywo w mikroskopie pionowym lub stereoskopowym należy użyć 6-, 12- lub 24-dołkowych optycznie odpowiednich płytek do hodowli tkankowych.
   4. Wybierz plastikowe szalki do hodowli tkankowych do masowego zbierania migrujących komórek grzebienia nerwowego w celu przeprowadzenia analiz o wysokiej przepustowości.
2. Dodaj 10 j./ml penicyliny i 10 μg/ml streptomycyny do 100 ml butelki sterylnego roztworu Ringera (na przykład 100 μl 10 000 j./ml penicyliny i 10 000 μg/ml streptomycyny, aby uzyskać P/S Ringera). Użyj P/S Ringera w ciągu 1 tygodnia.
3. Rozmrozić podwielokrotność 1 mg/ml FN na lodzie. Rozcieńczyć wskaźnikiem P/S Ringera do stężenia 10-100 μg/ml FN.
4. Odpipetować tyle roztworu FN, aby pokryć dno studzienki lub naczynia. Na przykład 100 μl na studzienkę w płytce 24-dołkowej, 500 μl na szalkę 35 mm.
5. Załóż pokrywkę i inkubuj naczynia lub talerze z roztworem FN w nawilżanym inkubatorze (lub przykrytej tacy z destylowanymi ręcznikami papierowymi nasączonymi wodą) w temperaturze 38 °C (100 °F) przez co najmniej 1 godzinę podczas preparowania fałdów nerwowych.

3. Wycinanie fałdów nerwowych

1. Przenieś zarodek do czystego naczynia zawierającego roztwór P/S Ringera i opłucz zarodek, trzymając ramkę bibuły filtracyjnej kleszkami i delikatnie przesuwając w przód iw tył, aby usunąć żółtko, które zasłania widok zarodka. Wymień P/S Ringera lub przenieś do świeżego naczynia, jeśli stanie się mętne.
2. Umieść zarodek stroną grzbietową/ramową do góry pod mikroskopem preparacyjnym. Pozostawiając zarodek na papierowej ramce, aby był napięty i utrzymywany na miejscu, usuń błonę witelinową za pomocą kleszczy, aby odsłonić fałdy nerwowe.
   nuta: Jeśli zarodek spadnie z papierowej ramy, można go rozłożyć płasko w naczyniu lub przypiąć do naczynia pokrytego sylgardem w celu sekcji.
3. Za pomocą nożyczek sprężynowych lub zaostrzonej igły wolframowej ostrożnie wyciąć fałdy nerwowe śródmózgowia. Uwzględnij tkankę ogonową do rozszerzających się pęcherzyków wzrokowych i rostralną do tyłomózgowia, gdzie zwężenia rombomerów dopiero zaczynają się pojawiać (półksiężyc serca jest również użytecznym wskaźnikiem, ryc. 1B, C). Uważaj, aby wyciąć najbardziej grzbietowy aspekt fałdu nerwowego z minimalnym zanieczyszczeniem cewy nerwowej i ektodermą nieneuronalną (ryc. 1C).
4. Przenieś fałdy nerwowe do czystego naczynia zawierającego P/S Ringera za pomocą pipetora P20 lub sterylnej, szklanej pipety Pasteura przepłukanej żółtkiem P/S Ringera (blokuje to plastik lub szkło, aby zapobiec przywieraniu tkanki). Przechowuj zebrane fałdy na lodzie podczas preparowania dodatkowych fałd.

4. Poszycie fałdów nerwowych

1. Rozmrozić podwielokrotność kompletnych pożywek hodowlanych (sekcja 1, krok 3). Dodać 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny i wysterylizować filtrem. Przygotowane podłoża należy przechowywać w temperaturze 37-38 °C podczas wykonywania innych czynności.
2. Wyjąć szalki hodowlane z inkubatora (sekcja 2, krok 5). Za pomocą pipety lub pipety Pasteura usuń roztwór FN z szkiełek nakrywkowych, szalek lub studzienek. Po przepłukaniu podłoża pokrytego FN za pomocą P/S Ringera, dodać odpowiednią objętość kompletnej pożywki hodowlanej do szalek lub studzienek (500 μl dla studzienek na płytce 24-dołkowej, 2 ml dla szalki 35 mm lub płytki sześciodołkowej).
   nuta: Mniejsze objętości mogą zachować drogie odczynniki (np. tak niskie, jak 200 μl dla płytki 24-dołkowej), ale upewnij się, że naczynie jest wystarczająco nawilżone, aby uniknąć parowania.
3. Używając pipetora p20 lub p200, najpierw przepłucz końcówkę pipety żółtkiem Ringera's P/S, aby zablokować plastik i zapobiec przywieraniu chusteczki. Następnie przenieś izolowane fałdy nerwowe na szkiełka nakrywkowe pokryte FN, uważając, aby przenieść jak najmniej Ringera P / S. Umieść zagięcie (fałdy) w kierunku środka szkiełka nakrywkowego pokrytego FN.
   nuta: Jeden lub kilka fałdów nerwowych można poszczepić na szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm w studzience 19 mm, do 50 na płytce o średnicy 35 mm.
4. Po pozostawieniu eksplantatów na 10-15 minut, umieść je w wilgotnej komorze o temperaturze 38 °C (100 °F), powoli i ostrożnie przenosząc szalki hodowlane z platerowanymi fałdami nerwowymi. Zminimalizuje to przesuwanie się fałdów nerwowych w studzienkach, zapewniając, że pozostaną one rozproszone i przylegają do wszelkich szkiełek nakrywkowych.
   nuta: W przypadku stosowania L15 (nie DMEM), naczynia z kultur eksplantatów można również inkubować w inkubatorze jaj za pomocą zakrytej tacy z zwilżonymi ręcznikami papierowymi.
5. Inkubuj kultury fałdów nerwowych w nawilżanym inkubatorze przez czas aktywnej migracji (łącznie około 16-20 godzin, ryc. 2).

Wyniki

Rysunek 1. Rozwarstwienie grzbietowych fałdów nerwowych pisklęcia. Pracując w Ringer's P/S, nożyczki sprężynowe były używane do wycinania fałdów nerwowych. (A) Widok grzbietowy zarodka, z przodu w kierunku górnej części rysunku. Fałdy nerwowe wydają się bardziej nieprzezroczyste niż otaczająca tkanka. Fałdy nerwowe śródmózgowia leżą z tyłu płatów wzrokowych (różowy) i z przodu do pó...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AxioObserver wyposażony w konfokalną głowicę skanującą LSM710 sterowaną za pomocą oprogramowania ZEN 3.0 SR	Zeiss		Używany obiektyw alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C3306
Naczynia komorowe (szklane dno, pojedyncze lub dzielone)	MatTek; Vis komórkowy	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	Pojedyncza komora 35 mm lub 4 komorowa 35 mm
Szkło nakrywkowe	Firma Zaopatrzenia Biologicznego Carolina	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	koła o grubości 0,13–0,17 mm, dostępne w średnicach 12–25 mm
DMEM/F12	ThermoFisher Naukowy	11320033	Alternatywa dla nośników L15
Inkubator do jaj	sportowiec	1502
FBS (Sieć Usługowa	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 10437-028
Fibronektyna	Fisher Naukowy	CB-40008A
Bibuła filtracyjna	Whatman		chromatografia stopnia 3MM
Kleszcze ()	Fisher Naukowy; Thomas Naukowy	08-890 (Rybak); 1141W97 (Tomasz)
Kleszcze (cienkie)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-20	Dumont #5
Uchwyt na sworzeń	Narzędzia naukowe	26016-12	Do igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3911
KH2PO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P0662
Nośniki L15	Invitrogen	11415064
L-glutamina	Invitrogen	Numer katalogowy 25030
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9638
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy S9888
Penicylina/streptomycyna	Technologie życiowe	Nr kat. 15140-148	10 000 jednostek/ml penicyliny; 10 000 mg/ml streptomycyny
Szalki Petriego	VWR (lub podobny)		60 mm, 100 mm
Nożyczki (rozwarstwienie)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14061-10
Nożyczki sprężynowe	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15000-08	Krawędź tnąca 2,5 mm (alternatywa dla igły wolframowej)
Sylgard	Krayden Krayden	ul. Sylgard 184
Filtry strzykawkowe	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Millex-GV Filtr strzykawkowy, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, sterylizowany promieniami gamma
Naczynia z kultur tkankowych	Sarstedt	Numer katalogowy: 83-3900	Szalki hodowlane 35 mm do masowych kultur fałdów nerwowych
Drut wolframowy	Różnorodność źródeł		Średnica 0,01 cala dla igły wolframowej (alternatywa dla nożyczek sprężynowych)

szt. powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: