Izolowanie neuronów zwoju przedsionkowego od ucha wewnętrznego myszy

Streszczenie

Źródło: Iyer, M. R. et al., Izolowanie i hodowla somatów przedsionkowych i spiralnych od noworodków gryzoni do nagrań typu patch-clamp.J. Vis. Exp. (2023).

Ten film prezentuje metodę izolowania neuronów przedsionkowych od wewnętrznego ucha szczeniaka myszy. Skrupulatnie przedstawia etapy związane z preparacją ucha wewnętrznego, pobraniem zwoju przedsionkowego, a następnie dysocjacją zwoju na pojedyncze komórki. Komórki te są następnie hodowane na szalkach ze szklanym dnem w celu ustanowienia hodowli neuronów przedsionkowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Przygotowania

UWAGA: Rozwiązania i narzędzia opisane w tej sekcji mogą być wykonane z dużym wyprzedzeniem i użyte w dniu sekcji i zapisu.

1. Przygotować pożywkę Liebovitz uzupełnioną 10 mM HEPES (roztwór L-15). Poniższe kroki opisują przygotowanie 1 litra roztworu L-15.
   1. Wlać 990 ml dejonizowanego_H2Odo jednej zlewki. Odmierz i dodaj 2,386 g (10 mM) HEPES. Dodać jedną butelkę 1 l roztworu L-15 w proszku.
      UWAGA: Sproszkowany L-15 ma dłuższy okres przydatności do spożycia i zajmuje mniej miejsca podczas przechowywania. Alternatywnie należy zakupić roztwór L-15 i uzupełnić go o HEPES. Ta ostatnia opcja ma również możliwość użycia roztworu bez fenolu, co jest przydatne do obrazowania fluorescencyjnego.
   2. Wymieszaj roztwór na talerzu do mieszania. Za pomocą pH-metru powoli dodawać 1 N wodorotlenku sodu (NaOH), aby uzyskać pH między 7,34 a 7,36.
   3. Dodawać dejonizowany_H2O, aż roztwór osiągnie objętość 1,000 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą membrany o wielkości porów 0,22 μm.
      nuta: Roztwór L-15 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie. W przypadku stosowania L-15 wykonanego z czerwieni fenolowej, roztwór zmieni kolor na różowy, jeśli jest zbyt zasadowy (pH > 7,4) lub pomarańczowy, jeśli jest zbyt kwaśny (pH < 7,34).
2. Przygotuj pożywkę hodowlaną dla neuronów zwojowych przedsionkowych (VGN). Wykonaj poniższe czynności, aby przygotować 50 ml pożywki hodowlanej:
   1. Dodać 47,5 ml minimalnej ilości niezbędnej pożywki GluMAX-I do czystej szklanej zlewki.
   2. Odmierz i dodaj 0,1194 g (10 mM) HEPES. Ten dodatkowy bufor jest odporny na zmiany pH, podczas gdy komórki osiadają przed przeniesieniem do inkubatora.
   3. Dodać 2,5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Daje to 5% objętości FBS w całkowitej objętości 50 ml pożywki.
   4. Wymieszaj roztwór na talerzu do mieszania. Za pomocą pH-metru powoli dodawaj 1 N NaOH, aby uzyskać pH między 7,38 a 7,4.
   5. Dodać 0,5 ml penicyliny-streptomycyny. Przefiltruj roztwór przez sterylny filtr 0,22 μm. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
   6. Co najmniej 30 minut przed użyciem przenieść pożywkę hodowlaną do kolby do hodowli tkankowej z wentylowaną nakrętką. Umieścić kolbę z pożywką w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.

2. Produkcja pipet trójkowych

UWAGA: Pipety do trójpodziału mogą być ponownie użyte do wielu eksperymentów. Przed każdym użyciem przepłukać pipety etanolem, wodą i roztworem L-15, a po każdym użyciu umyć je wodą i etanolem. Ostrożnie przechowywać między użyciami.

1. Aby przygotować pipety do dysocjacji komórek, przyłóż szklaną pipetę Pasteura do płomienia palnika Bunsena. Gdy szklana końcówka zacznie się topić, rozciągnij szklankę do żądanej średnicy końcówki. Odciągnij jeden koniec pipety od płomienia, aby utworzyć małe zagięcie.
2. Zbliż wygiętą pipetę do mikroskopu. Za pomocą płytki punktacji naciąć i rozbić szklankę o żądanej średnicy.
3. Przełóż końcówkę pipety nad górną częścią płomienia palnika Bunsena. Spowoduje to szybkie wypolerowanie szorstkich krawędzi w pobliżu końcówki. Sprawdź, czy końcówka nie jest uszczelniona przez płomień.
4. Powtarzaj ten proces, aż zostaną przygotowane cztery lub pięć pipet o różnych rozmiarach.

3. Ekstrakcja zwoju przedsionkowego i poszycie neuronów przedsionkowych

1. Przygotowanie do sekcji
   1. Przygotuj mieszaninę enzymatyczną roztworu L-15 z 0,05% kolagenazy i 0,25% trypsyny. Na przykład dodaj 0,001 g kolagenazy i 0,005 g trypsyny do 2 ml roztworu L-15 do zlewki, dodaj małe mieszadło magnetyczne i mieszaj, aż do całkowitego wymieszania. Odstawić w temperaturze pokojowej.
   2. Przygotuj komercyjnie uzyskaną gilotynę, umieszczając ręczniki papierowe z boku i pod gilotyną, aby zminimalizować narażenie blatu i innych powierzchni na krew i inne materiały biologiczne.
   3. Rozłóż duże nożyczki ze stali nierdzewnej, duże kleszcze i duże nożyczki sprężynowe. Trzymaj pod ręką dużą butelkę z rozpylaczem z 70% etanolem do czyszczenia głowy.
   4. Napełnij zlewkę o pojemności 100 ml roztworem L-15 i umieść ją na lodzie. Natlenić roztwór L-15.
   5. Rozłóż nożyczki sprężynowe, nożyczki chirurgiczne, kleszcze, skalpel i pipetę transferową (patrz Tabela materiałów).
   6. Przygotować szalkę Petriego o średnicy 60 mm (do rozwarstwienia ogólnego) i dwie szalki Petriego o średnicy 35 mm (do czyszczenia/dokładnego rozwarstwienia zwojów nerwowych). Napełnij naczynie o średnicy 60 mm natlenionym roztworem L-15 za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml z końcówką filtra 0,22 μm.
2. Eutanazja, czyszczenie głowy i hemisekcja
   1. Zważyć młode, aby obliczyć odpowiednią dawkę śmiertelnego rozcieńczenia plus do podawania dootrzewnowego (~0,01 ml na 10 g).
   2. Po osiągnięciu głębokiej płaszczyzny znieczulenia, ocenianej na podstawie braku reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, odetnij głowę za pomocą gilotyny.
   3. Dokładnie opłucz głowę 70% etanolem, a następnie dokładnie roztworem L-15.
   4. Całkowicie usuń skórę z czaszki. Przetnij głowę na pół za pomocą dużych nożyczek sprężynowych, zaczynając od punktu wejścia rdzenia kręgowego do mózgu i wykonując dwa cięcia, pierwsze przecięte przez górną część czaszki, a drugie przez dolną część szczęki. Zakończ przecinanie głowy na pół za pomocą nożyczek chirurgicznych.
   5. Umieść obie połówki głowy mózgiem do dołu na szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej roztworem L-15. Umieść świeżą tkankę, która nie jest aktualnie preparowana, na lodzie.
3. Ekstrakcja górnego zwoju przedsionkowego
   1. Wyjmij mózg za pomocą zamkniętych nożyczek chirurgicznych. Przeciąć i usunąć nerw czaszkowy, aby całkowicie odłączyć mózg od czaszki.
      nuta: W tym momencie torebka uszna (w kształcie cyfry 8) powinna być widoczna z tyłu głowy.
   2. Za pomocą kleszczy i zaczynając od tyłu głowy, ściągnij przezroczysty błoniasty materiał.
   3. Wytnij górną część czaszki za pomocą nożyczek chirurgicznych. Usuń nadmiar tkanki z tyłu głowy i szyi, aby obszar sekcji i kapsułka uszna były czystsze i łatwiej dostępne.
      nuta: Unikaj nadmiernego mętnienia potrawy, wyrzucając nadmiar tkanki przez cały czas trwania zabiegu.
   4. Przenieść tkankę na drugą szalkę Petriego ze świeżym roztworem L-15. Zlokalizuj torebkę uszną i nerwy słuchowe, przedsionkowe górne i przedsionkowe dolne. Odetnij nerw słuchowy i oddziel zwoje górne i dolne za pomocą małych nożyczek sprężynowych.
      nuta: Chociaż somaty nerwu przedsionkowego znajdują się zarówno w zwoju dolnym (cieńszym), jak i górnym (grubszym), komórki wyekstrahowane ze zwoju górnego mają lepszą przeżywalność.
   5. Za pomocą skalpela delikatnie ogol kostny grzbiet, aby osłabić obszar kostny, pod którym nerw zanurza się w kostnej torebce. Ostrożnie usuń zanieczyszczenia drobnymi kleszkami, odsłaniając całą spuchniętą część ganglionu.
   6. Użyj cienkich nożyczek sprężynowych, aby przeciąć i oddzielić ganglion od gałęzi nerwu obwodowego, która nurkuje w kierunku łagiewki.
   7. Usuń górny ganglion za pomocą cienkich kleszczy, uważając, aby nie uszczypnąć zbyt blisko tkanki zwojowej. Przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze świeżym roztworem L-15.
   8. Przed przystąpieniem do dalszych czynności podgrzej roztwór enzymu: wlej mieszaninę enzymów na szalkę Petriego o średnicy 35 mm i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 10-15 minut.
   9. Oczyść ganglion za pomocą cienkich kleszczy i małych nożyczek sprężynowych, usuwając kość (która wydaje się biała i skrystalizowana), nadmiar tkanki, włókna nerwowe i wszelkie inne zbędne struktury. Uważaj, aby zminimalizować usunięcie tkanki zwojowej.
4. Dysocjacja i powlekanie tkanek
   1. Przenieś oczyszczone zwoje jaj do wstępnie podgrzanego roztworu enzymatycznego i umieść go z powrotem w inkubatorze na 10 do 40 minut. Leczenie enzymatyczne jest zakończone, gdy tkanka zaczyna się rozpadać, ale pozostaje w jednym kawałku. Nadmierne traktowanie tkanki enzymami spowoduje całkowite rozpuszczenie zwojów przed roztarciem.
      UWAGA: Czas, w którym tkanka jest poddawana zabiegowi enzymatycznemu, zależy od wieku zwierzęcia. Na przykład zwoje szczurów P9 są traktowane enzymem przez 25 minut, a zwoje szczurów P15 są traktowane enzymem przez 35 minut.
   2. Przenieść zwoje na szalkę Petriego o średnicy 35 mm ze świeżym roztworem L-15 i inkubować przez 2-3 minuty.
   3. Przenieść zwoje na inną szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną przefiltrowanymi pożywkami hodowlanymi.
   4. Za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl odpipetuj kroplę ~150 μl przefiltrowanej pożywki hodowlanej na powlekane naczynie ze szklanym dnem. Nie dodawaj zbyt dużo roztworu, ponieważ ważne jest, aby utrzymać napięcie powierzchniowe, aby utworzyć pęcherzyk roztworu, który pozostaje nad szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
   5. Przenieś żądaną liczbę zwojów nerwowych (od jednego do czterech) do szkiełka nakrywkowego.
   6. Pobrać niewielką ilość pożywki hodowlanej z naczynia hodowlanego, aby przepłukać pipetę do rozcierania pożywką, aby zapobiec przywieraniu tkanki do boków szklanej pipety. Delikatnie i wielokrotnie przepuszczać tkankę przez pipetę, aż zwoje zostaną wystarczająco rozdzielone.
      nuta: Nie przepracowuj tkanki, aby spróbować zawiesiny pojedynczej komórki lub pozwól, aby komórki spadły na dno naczynia przy nadmiernym dodatnim ciśnieniu. Unikaj również tworzenia się pęcherzyków powietrza, ponieważ zmniejszy to przeżycie komórek. Delikatne rozcieranie jest kluczem do pomyślnego przetrwania komórek.
   7. Pozwól komórkom odpocząć przez 5 minut. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy komórki osiadły na szkiełku nakrywkowym.
   8. Ostrożnie umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 12-24 godziny. Ponownie upewnij się, że pęcherzyk roztworu pozostaje nienaruszony.
      nuta: W przypadku hodowli trwającej dłużej niż 24 godziny należy codziennie odświeżać pożywki hodowlane. Może to być możliwy punkt pauzy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement witaminy B27 (50x), bez surowicy	Thermo Fisher Naukowy	17504044	dodatek do pożywki hodowlanej, dla SGN
Zlewki (1000, 100, 10) mililitrów
Wirówka stołowa	USA Naukowe	2641-0016
Palnik Bunsena
Kolagenaza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C5318	jeden z trzech enzymów trawiących tkankę
Szkło nakrywkowe, prostokątne, grubość #1, 22x40	Instrumenty Warnera	64-0707
Dmso	Biot	Numer katalogowy 90082
Dnaza I, z trzustki bydlęcej	Sigma-Aldrich	11284932001	jeden z trzech enzymów trawiących tkankę
Kleszcze Dumont #3 ()	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11231-30
Kleszcze Dumont #5 (w porządku)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 11251-10
Kleszcze Dumont #55 (w porządku)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 11255-20
etanol	Laboratoria Decon	2716	do czyszczenia głowicy i okolic ławki sekcyjnej
Kapilary borokrzemianowe z włókien do elektrod	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał BF140-117-10
Ostrze preparacyjne o drobnych krawędziach	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10010-00
Szklane pipety Pasteura	Firma VWR	Numer katalogowy: 14673-010	do wyciągania pipet trójnikowych
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Naukowy	16140063	Dodatek do pożywki hodowlanej
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375-100G	do buforowania pH wszystkich roztworów w protokole
Mieszadła z płytą grzejną / magnetyczne	Firma VWR	Nr kat. 76549-914
Izolowane wiadro wypełnione lodem			aby wszystkie próbki i roztwory były chłodne
Duże nożyczki sprężynowe	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14133-13
Leibovitz medium	Sigma Aldrich	L4386	Roztwory do preparowania i kąpieli
Niskoprofilowa komora rejestrująca kąpiel do naczyń hodowlanych	Instrumenty Warnera	Numer katalogowy: 64-0236
Strzykawki Luer-Lok, 30 ml	Bd	302832	do pobierania roztworu L-15/HEPES/HEPES.
MEM + Suplement Glutamax	Fisher Naukowy	41-090-101	podstawa pożywki hodowlanej
Igła microFil do napełniania mikropipet - rozmiar 34	Światowe instrumenty precyzyjne	MF34G (Drukarka MF34G
Suplement N2 (100x)	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 17502-048	dodatek do pożywki hodowlanej, dla SGN
NaOH (1 m)	Thomas Naukowy	319511-500ML	do miareczkowania pH
Tlen, klasy medycznej, z odpowiednim regulatorem i rurkami	Gospodarka materiałowa USC	MEDOX200 (Identyfikator: 00015)	do rozpuszczania w roztworach preparacyjnych i kąpielowych
Parafilm	Bemis	Zobacz materiał PM992
Żarówka pipety Pasteura (3 ml)	Fisher Naukowy	03-448-25	Gruszka do pipet do rozcierania
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Naukowy	15140122	Dodatek zapobiegający zanieczyszczeniu pożywki hodowlanej
Roztwór do eutanazji na bazie pentobarbitalu (np. Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg)	MWI Zdrowie Zwierząt	Numer katalogowy: 15199	do eutanazji
Filtry membranowe PES, 0,2 mikrometra	Nalgene powiedział:	566-0020	do roztworów filtrujących
Sterylne filtry strzykawkowe z membraną PES, 0,22 um, 30 mm	CELLTREAT	229747	do filtrowania roztworów pobieranych do strzykawek
szalki Petriego, 35 x 10 mm	Genessee Scientific	32-103	do mikropreparacji i do przechowywania roztworu do zanurzania końcówki w konfiguracji z perforowaną łatą
Szalki Petriego, 60 x 15 mm	Naukowy Midland	Zobacz materiał P7455	do grubego rozbioru
pH-metr	METTLER TOLEDO	modelu S20
Pipety (1000, 200, 10) mikrolitrów	USA Naukowe
Naczynie hodowlane ze szkła pokrytego poli-d-lizyną	Mattek powiedział:	Zobacz materiał P35GC-0-10-C	do płytki neuronów do hodowli
Platforma szybkiej wymiany, podgrzewana podstawa, do naczyń hodowlanych 35 mm	Instrumenty Warnera	Numer katalogowy: 64-0375
Komórka odniesienia	Światowe instrumenty precyzyjne	Zobacz materiał RC1T
Ostrze skalpela	Miltex (Herbata	4-315
Rękojeść skalpela	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10003-12
Skala naukowa	METTLER TOLEDO	Zobacz materiał XS64
Pipety serologiczne (10, 25) mililitrów	Fisher Naukowy
Zestaw smaru silikonowego (do uszczelniania szkła nakrywkowego i komory)	Instrumenty Warnera	Numer katalogowy: 64-0378
Gilotyna dla małych zwierząt	Naukowy Kent	Protokół DCAP (DCAP
Gilotyna dla małych zwierząt	Naukowy Kent	Protokół DCAP (DCAP	do dekapitacji w przypadku preparacji szczurów starszych niż P15.
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Zeiss	Stemi 2000
Proste nożyczki chirurgiczne	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 14060-09
Strzykawka (3, 10, 30) mililitrów
trypsyna	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T1426	jeden z trzech enzymów trawiących tkankę
Strzykawka tuberkulinowa	Wirus Covidien	8881500105	do dostarczania roztworu do eutanazji we wstrzyknięciu dootrzewnowym
Nożyczki sprężynowe Vannas, krawędź tnąca 2,5 mm	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15000-08
Kolba miarowa, 1000 mililitrów
wir	Firma VWR	Numer katalogowy: 945300
Woda, sterylna, R>18,18 megaOhms cm (np. filtrowana przez system oczyszczania wody Millipore-Sigma)	Millipore-Sigma	CDUFBI001

TGL TGL ) TGL ) Pokój ) )