$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Dysocjacja tkanek
UWAGA: Wszystkie poniższe procedury są przeprowadzane w sterylnym komorze bezpieczeństwa biologicznego przeznaczonej do hodowli tkanek przy użyciu techniki aseptycznej i sterylnych materiałów.
- Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny zawierającej 0,53 mM EDTA do każdej stożkowej probówki o pojemności 15 ml z 9 ml DMEM i tkanki, aby rozpocząć lizę tkanki.
nuta: DMEM zawiera dużą ilość chlorku wapnia, który może działać jako inhibitor trypsyny. Jeśli dysocjacja nie jest zakończona zgodnie z opisanymi krokami, można zastosować zrównoważony roztwór soli Hanksa bez wapnia i magnezu. Po trypsynizacji enzym można zneutralizować poprzez dodanie inhibitora trypsyny, chociaż wapń należy dodać z powrotem do roztworu, ponieważ jest on kofaktorem dla DNazy I, który jest stosowany w kolejnych etapach.
- Rozprowadzić pipetą o pojemności 10 ml około 20 razy.
- Przenieść zawiesiny komórek do pustych probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
- Roztwór inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 15 minut, delikatnie mieszając lizaty po 8 minutach.
- Dodać 5 ml MGM i 200 μl (5 mg/mL) DNazy I do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 50 μg/ml.
- Potaryzować każdy lizat pipetą o pojemności 10 ml 10 razy.
- Pozostaw zawiesiny komórek na 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby umożliwić niezdysocjowaną tkankę osadzanie się na dnie probówek.
- Przenieś zawiesiny komórek do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml, pozostawiając niezdysocjowaną tkankę.
nuta: Opisane powyżej etapy lizy i rozcierania znacznie ograniczają ilość niezdysocjowanej tkanki.
- Odwirować probówki o sile 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C bez hamulca.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić pozostałe granulki komórek w 5 ml MGM.
- Rozetrzeć osad za pomocą pipety 5 ml 20x.
- Zawiesiny komórek o objętości 5 ml należy umieścić na powlekanych kolbach T25.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i początkowo zmienić pożywkę po 24 godzinach, aby usunąć resztki komórek.
nuta: Niektóre protokoły zalecają początkową wymianę nośnika po 72 godzinach. Może być wymagana optymalizacja tego kroku.
- Wykonuj 100% wymianę pożywki za pomocą MGM co 48-72 godziny, aż komórki będą zlewać się w 80% (około 5-7 dni).
UWAGA: Wszystkie media muszą być podgrzane do 37 °C przed wymianą nośnika.
2. Izolacja komórek prekursorowych oligodendrocytów
Podczas powlekania OPC po wstępnej izolacji, muszą one być pokryte powierzchnią pokrytą poli-D-lizyną (sterylna płytka lub szkiełko nakrywkowe). Przygotuj te materiały przed ukończeniem tej sekcji.
- Po 15 godzinach wstrząsania usunąć supernatant z kolb i ułożyć płytkę na sterylnej szalce Petriego o średnicy 100 mm.
- Inkubować supernatant w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut, mieszając po 15 minutach w celu usunięcia resztek mikrogleju, ponieważ te bardzo szybko przylegają do naczynia. Na tym etapie można użyć szalek Petriego niepoddanych hodowli tkankowej.
- Usunąć nieprzylegający supernatant komórek, policzyć i płytkę na powierzchni pokrytej poli-D-lizyną. Zazwyczaj platerowanych jest 7 500-10 000 OPC/cm2.
- Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę (do 6 godzin), następnie delikatnie zassać 95% pożywki i powoli dodawać ciepłe pożywki OPC, pipetując pożywkę do ścianki studzienki, aby zminimalizować zakłócenia OPC. Zmieniaj pożywkę co 48 godzin, aż ogniwa będą gotowe do użycia.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wymieniać tylko jedną studzienkę na raz. OPC są wrażliwe i szczególnie nietolerancyjne na suche warunki. Dodanie PDGF-AA do pożywki OPC ma na celu opóźnienie dojrzewania OPC do oligodendrocytów. Czynnik ten można wykluczyć z pożywek hodowlanych, jeżeli celem doświadczenia są dojrzałe oligodendrocyty.
Tabela 1: Receptury i mediów.
Mieszane podłoża glejowe (MGM)
| 88 ml | 1X DMEM (wysoki poziom glukozy, z L-glutaminą, z pirogronianem Na) |
| 10 ml | Inaktywowany termicznie FBS |
| 1,0 ml | L-Glutamina (100X) |
| 1,0 ml | Antybiotyk/Antybiotyk |
Nośniki OPC (50mL)
| 49 ml | Podłoże nerwowo-podstawne |
| 1,0 ml | Suplement witaminy B27 (50X) |
| 10 ng/ml | PDGF-AA |
| UWAGA: PDGF-AA jest dodawany na nowo przed każdą zmianą nośnika. |