Technika generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Streszczenie

Źródło: Boisvert, E. M., et al. Statyczna samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp (2020).

Ten film demonstruje technikę generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Przylegająca hodowla kolonii hESC jest traktowana enzymami w celu oderwania i rozbicia ich na klastry. Klastry te tworzą trójwymiarowe kule w zawieszeniu, które są następnie indukowane do różnicowania się w organoidy, które naśladują korę mózgową z warstwami neuronów i komórek glejowych.

Protokół

1. Utrzymanie komórek macierzystych

1. Utrzymuj hESC H9 na warstwie matrycy błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (patrz Tabela materiałów, odtąd nazywana po prostu matrycą) zgodnie z instrukcjami producenta.
   1. Aby pokryć jedną płytkę 6-dołkową lub jedno 10-centymetrowe naczynie, połącz 100 μl matrycy z 5,9 ml lodowatego zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM)/F12 firmy Dulbecco. Owinąć płytki folią parafinową i przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Stosować je następnego dnia do pasowania komórek po odessaniu nadmiaru matrycy/podłoża.
2. Hoduj komórki z tygodnia na tydzień w proporcji około 1:12 co 7 dni. Utrzymuj komórki za pomocą pożywki mTESR-1 w inkubatorze o niskiej temperaturze 37 °C (5%_O2, 5% CO₂). Codziennie odświeżaj multimedia. Odchwaszczaj komórki różnicujące z kultury między przejściami za pomocą szklanych narzędzi.
3. Komórki H9 powinny być pasażowane od czterech do sześciu dni przed wykorzystaniem ich do produkcji organoidów. Komórki powinny być pasażowane w stosunku około 1:8 skupisk komórek. Aby to zrobić, zacznij od przepłukania komórek zmodyfikowaną pożywką Dulbecco Eagle / mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) i dysocjuj komórki za pomocą neutralnej proteazy (np. Dyspazy, odtąd nazywanej po prostu proteazą), przepłucz DMEM / F-12 i ułóż płytki jako 30-60 klastrów komórek na 4 płytkach (6-dołkowych lub 10 cm) przy ~20% zbieganiu. Dwa dni przed zbiorem przenieś je do zwykłego inkubatora (21%_O2, 5% CO₂). Płytki powinny osiągnąć ~80% zbiegu po rozpoczęciu tworzenia organoidów.

2. Dysocjacja komórek macierzystych w hodowli organoidów

1. Podwielokrotnić roztwór podstawowy proteazy (5 j./ml).
   nuta: Zazwyczaj zamrażamy 1 ml porcji w temperaturze -20 °C do stosowania przez kilka miesięcy.
2. Rozcieńczyć roztwór podstawowy proteazy do stężenia roboczego, dodając 1 ml roztworu podstawowego plus 5 ml DMEM/F12 na każdą 6-dołkową lub 10-centymetrową płytkę hESC.
3. Odessać i usunąć pożywkę do hodowli komórkowych, a następnie przykryć hESC roztworem proteazy. Umieść płytki w inkubatorze na 10-15 minut lub do momentu, gdy krawędzie kolonii zaokrąglą się i zaczną oddzielać się od matrycy.
4. Przechylić płytkę, odessać roztwór proteazy i delikatnie umyć komórki trzykrotnie DMEM/F12. Stosować 2 ml / dołek do każdego mycia w przypadku płytki 6-dołkowej i 6 ml w przypadku płytki 10 cm. Upewnij się, że kolonie pozostają przyczepione do matrycy podczas wykonywania tego kroku.
5. Dodać z powrotem około 1,5 ml świeżej pożywki mTESR do każdego dołka (lub 5 ml w przypadku płytki 10 cm) i spłukać komórki z płytki za pomocą delikatnego pipetowania.
6. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml delikatnie zassać i dozować hESC wewnątrz płytki, aż osiągną około 1/30 swojej pierwotnej wielkości. Klastry kolonii powinny przypominać kwadraty o rozmiarach ~250-350 μm po zakończeniu tych kroków.

3. Generacja organoidów

1. Przenieś komórki do pojedynczej kolby T75 o bardzo niskim przyłączeniu zawierającej 30 ml pożywki mTESR bez podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
2. Następnego dnia przechyl kolbę (kolby) tak, aby żywe komórki zebrały się w rogu (może to zająć 5-10 minut pierwszego dnia, ale będzie szybsze w miarę powiększania się klastrów).
   nuta: Jeżeli na tym etapie lub w którymkolwiek kolejnym etapie do dna kolby przylega duża liczba komórek, należy przenieść komórki do nowej kolby. To normalne, że przez pierwsze dwa dni występuje duża liczba martwych komórek. Podczas wymiany nośnika należy usunąć jak najwięcej resztek komórek.
3. Gdy komórki osiądą, odessaj pożywkę i martwe komórki, pozostawiając około 10 ml pożywki zawierającej żywe komórki.
4. Dodaj ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF (DMEM/F12 uzupełniony 1x N2, 1x B27, 1x L-glutamina, 1x aminokwas endogenny (NEAA), 0,05% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1 mM monotioglicerolu (MTG) uzupełniony 30 ng / ml bFGF).
5. Sprawdź komórki w dniu 2. Jeśli większość komórek wygląda zdrowo i jasno, nie ma potrzeby nic robić. Jeśli jednak więcej niż jedna trzecia komórek wydaje się ciemna, zastąp pożywkę (przy użyciu tej samej techniki przechylania, co w kroku 3.2) ~20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 20 ng/ml bFGF.
6. W dniu 3 należy zastąpić połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki o niskiej zawartości bFGF uzupełnionej 10 ng/ml bFGF.
7. W 5 dniu zastąp połowę pożywki (stosując technikę przechylania w kroku 3.2) 20 ml pożywki do indukcji neuronalnej (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny).
   nuta: Jeśli istnieją jakiekolwiek duże skupiska komórek lub organoidów, które są znacznie większe niż inne, należy je usunąć z hodowli. Rozmiar szacuje się na podstawie wyglądu pod mikroskopem; Na przykład za pomocą okularu z siatką celowniczą. Większość organoidów ma podobne rozmiary (około 100 ± 20 μm). Usunęliśmy organoidy, które były około 2 razy mniejsze lub większe od pozostałych.
8. Połowę pożywki (~15 ml) (przy użyciu techniki przechylania) należy wymieniać na NIM co drugi dzień.
9. Po 3 tygodniach w hodowli dodaj 100x penicyliny/streptomycyny do pożywki (NIM: DMEM/F12, 1x suplement N2, 0,1 mM MEM NEAA, 2 μg/ml heparyny) w końcowym stężeniu 1x, jeśli jest to pożądane. Odświeżaj nośnik co drugi dzień.
   nuta: W ten sposób utrzymywaliśmy organoidy w hodowli przez okres do 6 miesięcy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement B27	Gibco, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 17504-044
bFGF (Fundusz Finansowy)	Life Technologies, Karlowe Wary, Kalifornia, Stany Zjednoczone	PHG0263
Bsa	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	A9647 (wersja angielska
Rozpuść	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	Numer telefonu 7913
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 11330-032
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	Gibco, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	10010023
Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu (Matrix)	Corning, Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	356231
H9 hNK	WiCell, Madison, WI, Stany Zjednoczone	WA09
heparyna	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	9041-08-01
L-glutamina	Gibco, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	25030-081
Monotioglicerol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał M6145
Nośniki mTESR	STEMCELL Technologies, Vancouver, Kanada	Numer katalogowy: 85850
N2 NeuroPlex	Gemini Bio Products, West Sacramento, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Rozdział 400-163
NEAA (Agencja Zdrowia)	Gibco, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 11140-050
Tryton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	T8787-100ML
Kolby T75 o bardzo niskim natężeniu	Corning, Corning, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 3814

) Klienta powiedział: