1. Brzuszne śródmózgowie i rozwarstwienie rdzenia kręgowego
UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki z wyjątkiem kroków 1.1.1−1.1.3 i 1.1.5−1.1.6 pod stereomikroskopem fluorescencyjnym. Całkowity czas sekcji na eksperyment wynosi zwykle 3-5 godzin, w zależności od biegłości w technice sekcji i liczby neuronów ruchowych wymaganych w każdym eksperymencie.
- Rozwarstwienie śródmózgowia brzusznego
- Poddaj ciężarnej myszy eutanazji około 11,5 dnia po zapłodnieniu przez gazowy dwutlenek węgla i zwichnięcie szyjki macicy.
- Dokładnie spryskaj brzuch etanolem i usuń macicę za pomocą sterylnych nożyczek do mikropreparowania i kleszczy opatrunkowych na kciuki. Umyj macicę krótko w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie przenieś na płytkę separacyjną wypełnioną wstępnie schłodzonym sterylnym PBS.
- Ostrożnie usuń zarodki IslMN: GFP (neuron ruchowy wysp trzustkowych: zielone białko fluorescencyjne) z macicy za pomocą sterylnych nożyczek do mikropreparacji, kleszczy do opatrunku kciuka i pęsety Dumont #5 w lodowatym sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w jasnym świetle mikroskopu. Używając sterylnej mini-perforowanej łyżki Moria, przenieś każdy zarodek do oddzielnego dołka na 24-dołkowej płytce wypełnionej wstępnie schłodzonym podłożem Hibernate-E o niskiej fluorescencji uzupełnionym 1x B27. Trzymaj płytkę 24-dołkową na lodzie.
- Przenieś jeden zarodek na sterylną płytkę preparacyjną i przykryj go całkowicie lodowatym sterylnym roztworem soli Hanka (HBSS).
- Upewnij się, że etapy preparacji są wykonywane przy oświetleniu mikroskopu izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC). Za pomocą pęsety usuń ogon i twarz zarodka, nie uszkadzając śródmózgowia (ryc. 1Ba). Umieść zarodek w pozycji leżącej z kończynami okrakiem pod spodem i ogonem skierowanym w stronę przodu mikroskopu, w kierunku sekcji (oznaczonej gwiazdką, ryc. 1Bb).
- Za pomocą pęsety rozetnij dach czwartej komory, aby wytworzyć mały otwór. Użyj tego otworu, aby zaczepić pęsetę w przestrzeni utworzonej między czwartą komorą a jej dachem. Rozkrój wzdłuż grzbietowej powierzchni zarodka rostralnego do kory i bocznie do płyty podłogowej i kolumny motorycznej (ryc. 1Ca,b). Otwórz wypreparowaną tkankę w sposób otwartej książki, aby odsłonić jądra neuronu okoruchowego GFP-dodatniego (nerw czaszkowy 3 [CN3]) i neuronu bloczkowego (nerw czaszkowy 4 [CN4]).
UWAGA: Mały fragment tkanki z brzusznego śródmózgowia zawierający mezenchymę, CN3 i CN4 zostanie teraz odsłonięty.
- Ostrożnie oddziel brzuszną część śródmózgowia od zarodka i usuń tkankę oponową za pomocą pęsety i mikronoża preparacyjnego. Wypreparuj obustronne jądra CN3 i CN4 GFP-dodatnie z dala od płytki podłogowej i innych otaczających tkanek GFP-ujemnych za pomocą pęsety i noża do mikropreparowania (Figura 1D). Zmaksymalizuj liczbę neuronów ruchowych GFP-dodatnich w wyciętej tkance, ale unikaj ich dotykania lub uszkadzania.
- Jeśli pożądany jest zbiór oddzielnych jąder CN3 i CN4, należy przeciąć wzdłuż linii środkowej tych dwóch jąder (żółta linia przerywana na rysunku 1D). Za pomocą pipety P1000 zbierz wypreparowaną brzuszną tkankę śródmózgowia z minimalnym HBSS i umieść ją w oznakowanej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml wypełnionej pożywką do preparacji. Przechowywać na lodzie do momentu dysocjacji.
- Kontynuuj łączenie brzusznego śródmózgowia z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymóg eksperymentalny (patrz krok 4 dla idealnej liczby komórek).
UWAGA: Zalecana jest zbiorcza kolekcja co najmniej 10 brzusznych śródmózgowia dająca około 1 x 104 neuronów ruchowych CN3 / CN4, ponieważ tkanki są narażone na stres podczas dysocjacji i sortowania.
- Rozwarstwienie brzusznego rdzenia kręgowego
- Trzymaj zarodek w pozycji leżącej z głową skierowaną do przodu mikroskopu, w kierunku dysektorium. Przytrzymaj zarodek jedną parą pęsety i włóż końcówkę drugiej pary pęsety do nieotwartej ogonowej części czwartej komory.
- Otwórz resztę tyłomózgowia i rdzeń kręgowy grzbietowo na całej długości ogonowej zarodka. Otwórz przez przecięcie tkanki grzbietowej, zaczynając od czwartej komory i kierując się w stronę centralnego kanału ogonowego rdzenia kręgowego, używając kleszczy jako nożyczek (ryc. 1Ca,b). Uważaj, aby podczas tego zabiegu nie dotykać ani nie uszkodzić brzusznego rdzenia kręgowego.
- Przytrzymaj zarodek jedną parą pęsety i ściśnij płatek tkanki grzbietowej z każdej strony drugą parą pęsety (ryc. 1Ea,b).
UWAGA: Wycięte tkanki grzbietowe zawierają skórę grzbietową, mezenchymę, zwoje korzenia grzbietowego (DRG), grzbietowe tyłomózgowie i rdzeń kręgowy. Usuń jak najwięcej tych tkanek bez uszkadzania jąder rdzeniowego neuronu ruchowego (SMN), ponieważ są one adhezyjne i mogą zatrzymywać SMN podczas filtrowania lub powodować zatykanie podczas sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS).
- Usuń brzuszny rdzeń kręgowy za pomocą noża do mikrodysekcji, aby przebić się bezpośrednio pod GFP-dodatnim SMN. Podnieś brzuszny rdzeń kręgowy ruchami przypominającymi piłę po obu stronach (ryc. 1Fa,b). Przeciąć pływający brzuszny rdzeń kręgowy poprzecznie bezpośrednio nad C1, gdzie wystaje pierwszy przedni róg GFP-dodatni (ryc. 1G). Przeciąć również poprzecznie na górnej granicy kończyny dolnej (ryc. 1G). Po tym zabiegu należy usunąć część szyjno-lędźwiową (L2-L3) brzusznego rdzenia kręgowego.
- Umieść brzuszny rdzeń kręgowy grzbietową stroną do góry i przytrzymaj, naciskając tkankę GFP-ujemną między kolumnami GFP-dodatniego SMN za pomocą jednej pary pęsety. Usuń pozostałą przyczepioną mezenchymę, DRG i grzbietowy rdzeń kręgowy, przycinając obie strony kolumny SMN GFP-dodatniej za pomocą noża do mikrodysekcji (Figura 1H). Zadbaj o to, aby zmaksymalizować neurony ruchowe GFP-dodatnie bez ich uszkadzania.
- Za pomocą pipety P1000 zebrać wypreparowaną tkankę brzusznego rdzenia kręgowego z minimalnym HBSS i umieścić w znakowanej SMN probówce do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml wypełnionej pożywką do preparacji. Przechowywać na lodzie do momentu dysocjacji. Kontynuuj łączenie brzusznych rdzeni kręgowych z dodatkowych zarodków w tej samej probówce, aż całkowita liczba spełni wymagania doświadczalne.
nuta: Zaleca się pobranie co najmniej trzech brzusznych rdzeni kręgowych o wartości około 2,1 x10 4 SMN, ponieważ tkanki są narażone na stres podczas dysocjacji i sortowania.
- Zbierz neurony ruchowe twarzy i kończyny zarodków myszy IslMN: GFP jako kontrole GFP-dodatnie i GFP-ujemne odpowiednio do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Kończyny są GFP-ujemne, ponieważ aksony GFP-dodatnie SMN nie rozszerzyły się jeszcze na kończyny w tym wieku embrionalnym.
2. Dysocjacja tkanek
UWAGA: Całkowity czas dysocjacji wynosi zazwyczaj 1,5 godziny na eksperyment.
- Ciepły roztwór papainy i inhibitora albuminy i owomukoidu podsycić do 37 °C 30 minut przed dysocjacją.
- Krótko odwiruj mikro wypreparowane tkanki z małą prędkością.
- Za pomocą pipety P100 ostrożnie usuń jak najwięcej Hibernate E bez zasysania tkanek.
UWAGA: Pamiętaj, aby usunąć wszystkie pozostałości Hibernate E po tym kroku, aby uniknąć zmniejszenia skuteczności dysocjacji papainy w następnym kroku.
- Dodać odpowiednią objętość roztworu papainy (Tabela 1) do każdej z 1,7 ml probówek do mikrowirówek zawierających mikrowycięte próbki tkanek.
UWAGA: Odpowiednia objętość papainy do dysocjacji została określona w celu maksymalizacji efektywnej dysocjacji przy jednoczesnej minimalizacji stresu na komórkach.
- Delikatnie rozetrzeć 8x pipetą P200. Wykonaj wszystkie kroki rozcierania delikatnie, aby zachować żywotność neuronów ruchowych.
- Inkubować probówki zawierające tkanki przez 30 minut w temperaturze 37 °C, mieszając przez przesuwanie palcem 10 razy co 10 minut. Po inkubacji delikatnie rozetrzeć każdą zawiesinę 8 razy pipetą P200. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut.
- Aby zapewnić skuteczność hamowania jaju w następnym kroku, użyj pipety P1000, aby usunąć i wyrzucić jak najwięcej supernatantu bez zasysania tkanek.
- Zawiesić osady w odpowiedniej objętości roztworu inhibitora albuminy i owomukooidów (Tabela 1), delikatnie rozcierając 8x pipetą P200.
- Odczekaj 2 minuty, aby pozostałe kawałki niezdysocjowanej tkanki osiadły na dnie probówki.
- Zebrać jak najwięcej supernatantu bez zasysania niezdysocjowanych tkanek za pomocą pipety P200. Przenieść supernatant do świeżych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml.
- Jeśli niektóre fragmenty tkanki pozostaną niezdysocjowane po kroku 2.10, powtórz kroki 2.8−2.10 dla niezdysocjowanych tkanek, które pozostają w oryginalnych probówkach mikrowirówek o pojemności 1.7 ml, aby zmaksymalizować końcową wydajność zdysocjowanych komórek, jednocześnie minimalizując stres na komórkach zdysocjowanych wcześniej, zawartych w supernatancie kroku 2.10.
- Wirować komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety P1000.
- Zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki rozwarstwiającej (Tabela 1), pipetując 8x za pomocą pipety P1000. Odpowiednią objętość zawiesiny końcowej określono tak, aby gęstość komórek nie przekraczała 107 komórek/ml, co może blokować strumień cytometrii przepływowej, ale także aby komórki nie były nadmiernie rozcieńczane, co skutkuje spowolnieniem prędkości sortowania.
- Przefiltruj zawiesiny przez sitka komórkowe o wielkości 70 μm, aby wyeliminować wszelkie duże grudki lub niestrawioną tkankę. Przenieść zawiesiny do probówek z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i przechowywać na lodzie do momentu, gdy będą potrzebne.
3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany przy użyciu sortera FACS wyposażonego w fioletowy laser 15 mw 405 nm, niebieski laser 100 mw 488 nm, pomarańczowy laser 75 mw 594 nm i czerwony laser 40 mw 640 nm. Komórki posortowano jako płyn osłonkowy w sterylnym PBS w warunkach aseptycznych przez dyszę 100 μm. W celu zminimalizowania stresu komórkowego, natężenie przepływu ustawiono na ciśnienie próbki 1−3, tak aby uzyskano maksymalnie 1000−4000 zdarzeń na sekundę. Całkowity czas FACS wynosi zwykle 1-2 godziny na eksperyment.
- Ustaw napięcia dla rozproszenia do przodu i bocznego, aby można było prawidłowo zobrazować populację komórek. Ustawienie odpowiednich napięć do sortowania ogniw jest skomplikowane i wymaga doświadczonego operatora FACS.
- Aby rozróżnić różne populacje komórek, należy wykreślić komórki na podstawie rozmiaru określonego przez obszar rozproszenia do przodu (FSC-A) w porównaniu ze złożonością wewnętrzną określoną przez obszar rozproszenia bocznego (SSC-A). Narysuj bramkę wokół żywych komórek, jak pokazano na rysunku 2Aa i rysunku Ba, aby wykluczyć zanieczyszczenia i martwe komórki. Pogrupuj komórki w regionie bramkowanym jako populację 1 (P1).
- Aby wykluczyć skupiska komórek i dublety, wykreśl komórki P1 następnie na podstawie szerokości rozproszenia bocznego (SSC-W) w porównaniu z SSC-A. Bramka populacji pojedynczych komórek jako populacji 2 (P2) (Rysunek 2Ab i Rysunek Bb).
- Wykreśl komórki P2 w oparciu o szerokość rozproszenia do przodu (FSC-W) w porównaniu z FSC-A i zabramuj populację pojedynczych komórek jako populację 3 (P3) (Rysunek 2Ac i Rysunek Bc).
nuta: Zastosowanie dwóch kolejnych bramek w 3.3 i 3.4 wyklucza grudki komórek i dublety (wysoki FSC-W i wysoki FSC-A).
- Komórki bramki P3 oparte na GFP kontra allofikocyjanina (APC). Kanał APC wykrywa autofluorescencję. Bramkowanie na tym kanale pozwala uniknąć wychwytywania komórek autofluorescencyjnych. Użyj ogniw GFP-ujemnych, aby dostosować napięcie dla kanałów fluorescencyjnych FITC/GFP. Idealnie, umieść bramki dla tych populacji komórek około 102. Wybierz progi bramki dla populacji GFP-dodatniej 4 (P4) indywidualnie dla każdego typu neuronu ruchowego (Figura 2Ad i Figura Bd).
UWAGA: Ustaw bramkę GFP znacznie wyżej dla SMN niż dla CN3s/CN4s, aby uzyskać czystą kulturę (Rysunek 2Ad i Rysunek Bd). Dolna bramka GFP dla kultur SMN prowadzi do zanieczyszczenia kultur przez neurony glejowe i nieruchowe. Jest to prawdopodobne, ponieważ w niektórych neuronach glejowych i nieruchowych występuje niski poziom ekspresji GFP z powodu nieszczelnego promotora. Odsetek komórek GFP-dodatnich w porównaniu z komórkami ogółem wynosi zwykle 0,5-1,5% dla CN3 / CN4 i 1,5-2,5% dla SMN. Jeśli sekcja zakończyła się sukcesem, liczby te można wykorzystać jako punkt odniesienia do określenia odpowiedniej pozycji bramki GFP-dodatniej (rysunek 2Ae i rysunek Be).
- Wykonaj FACS zgodnie z protokołem producenta. Zbierz komórki P4 do świeżych probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,7 ml wypełnionych 500 μl pożywki do hodowli neuronów ruchowych. Przechowywać na lodzie do momentu poszycia.
nuta: Chociaż komórki można sortować bezpośrednio do studzienek, powoduje to nieparzystą liczbę komórek na studzienkę. Posortuj komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,75 ml, a następnie ręcznie płytkuj, aby uzyskać bardziej równomierny rozkład posiewu.
4. Kultura oczyszczonych pierwotnych neuronów ruchowych
- Rozcieńczone zawiesiny CN3/CN4 i SMN izolowane metodą FACS za pomocą pożywki do hodowli neuronów ruchowych podgrzanej do 37 °C do gęstości odpowiednio 5 x 103 i 1 x 104 komórek/ml.
nuta: Jeden zarodek E11.5 daje około 1 x 103 CN3 / CN4 i 7 x 103 SMN. Jednak plony te zależą w dużej mierze od czystości wypreparowanych tkanek, dokładności dysocjacji komórek i odpowiedniego progowania bramek GFP podczas FACS.
- Przenieść 96 płytek dołkowych wstępnie pokrytych poli-D-lizyną (PDL) i lamininą z inkubatora do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C do okapu z przepływem laminarnym i odessać lamininę z każdej studzienki. Płytki i szkiełka nakrywkowe należy zużywać natychmiast bez mycia.
- Dodać 200 μl rozcieńczonych zawiesin CN3/CN4 i SMN do każdej studzienki 96-dołkowych płytek pokrytych PDL/lamininą. Końcowe zagęszczenie komórek powinno wynosić 1 x 103 i 2 x 103 komórki/studzienkę odpowiednio dla CN3/CN4 i SMN.
nuta: Początkowa gęstość posiewu SMN w 96 dołkach (2 x 103 komórki / dołek) jest dwukrotnie większa niż CN3s / CN4 (1 x 103 komórki / dołek) w celu uzyskania podobnej końcowej liczby i gęstości neuronów ruchowych po 2 i 9 dniach in vitro (DIV) (4−6 x 102 i 2−4 x 102 komórki na studzienkę, odpowiednio).
- Hodowla neuronów w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
- Karmić neurony co 5 dni, usuwając połowę starej pożywki (100 μl) i zastępując ją taką samą objętością świeżej pożywki hodowlanej neuronów ruchowych. Upewnij się, że procesy neuronalne stają się widoczne na 1 DIV i stają się grubsze i dłuższe o 14 DIV (ryc. 3). Ciała komórek nerwowych ulegają powiększeniu i mają tendencję do agregacji w długotrwałych hodowlach, szczególnie w przypadku SMN (ryc. 3).
UWAGA: Wykonaj wszystkie zmiany pożywki i roztworu, pozostawiając połowę pierwotnej objętości pożywki, aby uniknąć oderwania hodowanych komórek. Obejmuje to etapy fiksacji i immunocytochemii (ICC). Jeśli wszystkie media zostaną usunięte, niezależnie od tego, jak delikatnie, większość komórek oderwie się i zostanie zmyta.
